توبال علم الخلايا من أنبوب فالوب كأداة واعدة لسرطان المبيض الكشف المبكر

Summary

استكشفنا طريقة ستولوجيك الأنبوبي عن طريق أخذ العينات أنبوب فالوب مباشرة بعد الجراحة الختان كأداة للكشف المبكر عن سرطان المبيض. هنا، نقدم بروتوكول لجمع خلايا أنبوب فالوب من العينات الجراحية تلقى حديثا.

Abstract

حاليا، فمن المقبول على نطاق واسع أن الغالبية العظمى من المبيض عالية الجودة سرطان المصلية (هغسك) تنشأ من قناة فالوب. ومع ذلك، نظرا لعدم وجود علامات أو أدوات لتحديد سرطان المبيض، والكشف المبكر عن هغسك لا يزال تحديا. أخذ العينات المباشرة من قناة فالوب يمكن أن تعزز حساسية للكشف عن الخلايا الورمية عندما الورم ليس مرئيا بشكل واضح. وضعنا إجراء لجمع خلايا أنبوب فالوب مباشرة من العينات الجراحية تلقى حديثا، والتي أظهرت علاقة ممتازة مع النتائج النسيجية. هذا النهج يضع أساسا للمنفعة المستقبلية للفحص بالمنظار الحد الأدنى في مجموعات المرضى عالية المخاطر.

Introduction

سرطان المبيض عالية الجودة المصلية (هغسك) هو النوع الأكثر شيوعا وقاتلة من سرطان المبيض، ولا يزال يشكل تهديدا كبيرا للصحة العامة. في العقد الماضي، اقترح الباحثون أن الغالبية العظمى من الحالات هغسك تنشأ من قناة فالوب بدلا من المبيض نفسه ^{1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6} . ومن المسلم به على نطاق واسع سرطان داخل الظهاري البوقي (ستيك) باعتبارها مقدمة من هغسك ^{1 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11} . وحتى الآن، لا يزال الكشف المبكر عن سرطان المبيض صعبا. وقد أظهر بروتوكول الفحص الحالي مع مستضد السرطان مجتمعة 125 (كا-125) والموجات فوق الصوتية عبر المهبليتأثير قليل على وفيات المرضى ^{12 ، 13} . أظهرت عينات بطانة الرحم للكشف عن سرطان المبيض حساسية منخفضة للغاية ¹⁴ . دراستان رائدة ^{15 ، 16} استكشاف استخدام بالمنظار أخذ العينات المباشرة من أنابيب فالوب حميدة ويتميز السمات الخلوية من ظهارة الأنبوبي حميدة. ونحن نعتقد أن أخذ العينات مباشرة من قناة فالوب يمكن أيضا أن تكون وسيلة عملية ومباشرة للكشف عن ستيك أو هغسك في مرحلة مبكرة عندما لا يتم تصوير الورم عن طريق التصوير.

على الرغم من أن الهدف النهائي هو فائدة فحص بالمنظار الحد الأدنى في المرضى الذين يعانون من عوامل عالية الخطورة، والأهداف المباشرة للدراسة الحالية هي: 1) لإنشاء السمات الخلوية الأساسية من ظهارة حميدة الأنبوبي. و 2) لاختبار حساسية وخصوصية الخلايا البوقية في الكشف عن سرطان المبيضإرس وسلائف السرطان. لذلك قمنا بتطوير أساس الخلايا الأساسية طريقة الخلايا التالية لاختبار فعالية هذا البروتوكول في الكشف عن هغسك وسلائفها ستيك ¹⁷ . في هذه الدراسة، استفدنا من الحجم الكبير من العينات الجراحية المستلمة بانتظام، وأجرينا عينات مباشرة من أنبوب فالوب الذي تم استئصاله جراحيا بالإضافة إلى إجراءات إحصائية روتينية.

وأظهرت دراستنا الأخيرة ¹⁷ أن التشخيص الخلوي من الخبيثة أو الاشتباه للخبيثة يرتبط ارتباطا وثيقا التشخيص النسيجي لل هغسك (100٪). وبالإضافة إلى ذلك، حدد التقييم الخلوي البوقي نيوبلسا داخل الرحم في حالتين ستيك أكدها نسيجيا فقط المشاركة في هذه الدراسة. ونحن نعتقد أن الخلايا البوقية لديها امكانيات كبيرة في الكشف المبكر، وسوف توفر معلومات قيمة لإدارة المريض.

Protocol

وقد تم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية من جامعة أريزونا لإجراء هذه الدراسة. تم الحصول على استمارات موافقة المريض على علم.

1. اختيار المريض

ملاحظة: تم الحصول على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية من جامعة أريزونا. وتم تجنيد 38 مريضا. تراوحت أعمار المرضى بين 32 و 86 سنة بمتوسط ​​55 عاما، منهم 26 مريضا بعد انقطاع الطمث و 12 مريضا كانوا قبل انقطاع الطمث.

1. الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض.

2. فالوبي أنبوب خلايا مجموعة الإجراء

ملاحظة: كان جميع المرضى المدرجة في الدراسة الحالية مجدولة لاستئصال الرحم الكلي والثنائي سالبينغو- أوفوركتومي إما للحد من مخاطر وقائي أو الخبيثة. تفاصيل الجراحة كانت غير معروفة لعلم الأمراض الذي قام بدراسة علم الخلايا.

1. مباشرة بعد سرجيكال فحص، فحص عينة الأنسجة الطازجة بما في ذلك الرحم والمبايض الثنائية، وقنوات فالوب الثنائي بعناية لتحديد أنبوب فالوب الثنائي.
2. جمع ووضع خلايا أنبوب فالوب في الحل الحافظة (انظر الجدول من المواد) قارورة في غضون 30 دقيقة من لقط إمدادات الدم. والحافظة الموصى بها هو القائم على الميثانول، حل الحافظة مخزنة.
   ملاحظة: استخدام فرشاة اللمس لطيف لجمع الخلايا البوقية (الخطوات القادمة). باستثناء الحالات النادرة التي يتم فيها تقديم أنبوب فالوب منفصلة عن الرحم، وإدخال رأس فرشاة لجمع الخلايا من المخيم الأنبوبي يحدث عادة عندما يتم ربط أنبوب فالوب إلى الرحم.
   1. مع مساعدة من ملقط صغير، إدراج فرشاة (انظر الجدول من المواد ) في التجويف من قناة فالوب من خلال نهاية فيمبرياي. تدور ببطء في اتجاه عقارب الساعة ونقل الفرشاة إلى الأمام من خلال الجزء القمعي من الخريفأنبوب أوبيان، ثم أمبولة حتى تصل إلى البرزخ.
   2. تدوير ببطء وعكس فرشاة عكس اتجاه عقارب الساعة لسحب الفرشاة. تأكد من أن السرعة القصوى للفرشاة داخل التجويف أبطأ من 1 سم / ثانية.
   3. شطف فرشاة في الحل الحافظة (في قارورة) عن طريق تناوب ودوامة الفرشاة 10 مرات في الحل.
   4. تشديد غطاء قنينة.
   5. تسجيل معلومات المريض وأثرية العينة.
   6. تخزين القارورة في ثلاجة 4 درجات مئوية (لمدة تصل إلى) 6 أشهر.

3. توبال علم الخلايا إعداد الشريحة

1. تحميل قارورة عينة في المعالج الآلي لإعداد الشريحة.
   ملاحظة: نحن نستخدم المعالج الآلي لإعداد الشريحة. يتم تنفيذ الخطوات التالية تلقائيا بعد يتم وضع قارورة عينة في المعالج: (1) يتم فصل الخلايا والحطام وتفريقها من خلال دوران مرشح الاختبار داخل العينةقارورة. (2) يتم جمع الخلايا البوقية من السطح الخارجي للمرشح بواسطة فراغ لطيف. (3) مقلوب مرشح وضغط ضد الشريحة للسماح للخلايا على التمسك المنطقة الدائرية داخل الشريحة. (4) يتم تثبيت الشريحة أيضا في حمام مثبت الخلية وعلى استعداد لتلطيخ وتحليل الخلايا. لسوء الحظ، لا يوجد طريقة يدوية بديلة، والتي يمكن أن تسفر عن نتائج ذات جودة مماثلة.

4. تعديل بابانيكولاو تلطيخ البروتوكول

1. وصمة عار الشرائح المصنوعة من الخطوة 3.1 عن طريق تشغيل الآلي غير اللطخة إجراء اللطخة، كما هو موضح في الجدول 1 .
   ملاحظة: طريقة تلطيخ يمثل تعديل تقنية تلطيخ بابانيكولاو التي نستخدمها بشكل روتيني للعينات غير الجهاز التناسلي للمرأة. نحن نستخدم معالج الأنسجة الآلي لصمة عار بعض الشرائح. اخترنا إجراء تلطيخ غير جين على إجراء تلطيخ جين في هذه الدراسة. يوزين المستخدمة هو إي-65، بدلا من إي-50 المستخدمة لعينات أمراض النساء (عينة مسحة باب). وبالإضافة إلى ذلك، لم يتم تضمين أوغ-6 في إجراء تلطيخ جين، والتي هي أساسا لتلطيخ الخلايا الحرشفية، في إجراء تلطيخ لأنه لا يتوقع أن ينظر إلى الخلايا الحرشفية في هذه الدراسة. EA65 (يوزين أزور) هو حل وصمة عار مضادة تتألف من 3 الأصباغ: يوسين Y، فف الأخضر سريع، وبسمارك براون Y. ويوضح هذا الإجراء في الجدول 1 .
2. إجراء إجراء سريع الباب وصمة عار على النحو التالي.
   1. تراجع الشريحة المحرز في الخطوة 3.1 في الايثانول 95٪، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   2. تراجع الشريحة في H ₂ O، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   3. تظهر الشريحة في الهيماتوكسيلين لمدة 10 - 60 ثانية.
   4. تراجع الشريحة في H ₂ O، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   5. تراجع الشريحة في الايثانول 95٪، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   6. تظهر الشريحة في EA65 لمدة 1 - 3 دقائق.
   7. تراجع الشريحة إنتo H ₂ O، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   8. تراجع الشريحة في الايثانول 95٪، 10 مرات، مع كل تراجع يستغرق حوالي 1 ثانية.
   9. تراجع الشريحة في زيلين حتى تصبح الشريحة واضحة.
      ملاحظة: هذا هو إجراء تلطيخ بابانيكولاو تعديل. يستخدم هذا الأسلوب كطريقة وصمة عار أكثر سرعة للحالات مع وقت محدود أو الفضاء مثل الموقع طموح إبرة غرامة وعينات ستات. يوفر هذا الإجراء تلطيخ جودة قابلة للمقارنة كما أوتوماتد غير اللطخة الإجراء. ويوضح هذا الإجراء في الجدول 2 .

5. تدور الخلايا على الشرائح

ملاحظة: ثلاث شرائح سيتوسبين مصنوعة لكل عينة. شريحة واحدة H & E ملطخة للمقارنة المورفولوجية مع شريحة علم الخلايا. وقدمت اثنين من شرائح غير ملوثين لدراسة إهك تلطيخ في المستقبل. إن الخطوات التفصيلية لهذا القسم ليست محور هذه الورقة. وبالتالي، فإننا لن نناقشها في د طويلةetails على.

1. إعداد سيتوكنتريفوج مع شريحة المسمى، عينة القمع وتصفية لكل عينة لفحصها.
2. تركيز الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
3. إزالة حوالي نصف طاف ثم إعادة تعليق الخلايا عن طريق بيبتينغ لطيف.
4. إضافة 200 ميكرولتر من كل تعليق خلية لقمع عينة.
5. تدور في 250 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة بعناية الشريحة (ق) من سيتوسنتريفوج ونقلها إلى الإيثانول 95٪ للتثبيت.
6. الهواء الجاف قبل تلطيخ والتخزين على المدى الطويل.
   ملاحظة: اعتمادا على كثافة الخلية على الشرائح النهائية، يمكن تخطي الخطوة 5.2 والخطوة 5.3 أو تعديلها. في هذه الدراسة، ونحن نطلب على الأقل 2 مجموعات الخلايا الموجودة في عرض الطاقة العالية للكثافة الخلوية كافية.

.6 التقسيم والتفتيش على نطاق واسع لبروتوكول نهاية فيمبريتاتد (سي-فيم)

1. إصلاح العينة بأكملها (بما في ذلك الرحم، وقنوات فالوب الثنائية، والمبايض)في الفورمالين 10٪ قبل إحصار لتقليل التقشير.
2. فصل بلطف وبعناية أنابيب فالوب من الرحم في البرزخ باستخدام ملقط صغير ومقص. إذا التصاق موجود، تشريح بعناية نهاية فيمبريتد من سطح المبيض باستخدام ملقط صغيرة ومقص. هذه الخطوات حاسمة للحد من التلوث عبر الورم بين المبيض وقناة فالوب نظرا لقربهم الحميمة.
3. بتر البوق و فيمبرياي الجزء (القاصي 1.0 - 2.0 سم من فالوب أنبوب) من بقية العينة.
4. قسم القمع و فيمبريا طوليا في فترات 2 ملم. تقديم جميع أقسام في توتو للفحص نسيجية.
5. قسم البرزخ وأمبولة في فترات 2-3 ملم وتقديم كامل.

النتائج

وأظهرت دراستنا السابقة أن أخذ العينات مباشرة من أنبوب فالوب استئصال باستخدام فرشاة لمسة لطيف يمكن أن تسفر عن عينة كافية وكمية كافية لمزيد من التقييم الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الجمع بين إعداد الشريحة الآلي وتعديل بابانيكولاو تعديل تمكن الطبيب ...

Discussion

وقد تبين أن استئصال سالبينجكتومي الثنائي أو وقائي سالبينغو-أوفوركتومي يقلل من خطر تطوير هغسك في السكان المعرضين للخطر، مثل النساء مع الطفرات الجينية بركا وتاريخ السرطان العائلي قوي. ومع ذلك، فإن عقم وانقطاع الطمث الجراحية الناجمة عن الجراحة هي عواقب وخيمة وجعل قرا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786