卵巣癌早期発見のための有望なツールとしてのファロピウス管の管細胞診

要約

われわれは、卵巣がんの早期発見のツールとして、卵管直腸切除後の卵管をサンプリングすることによって、卵管細胞診法を検討した。ここでは、新たに受けた外科標本からファローピウス管細胞を収集するためのプロトコルを提示する。

要約

現在、大部分の卵巣高悪性度漿液癌（HGSC）は、卵管から生じることが広く受け入れられている。しかし、卵巣癌の同定のためのマーカーまたはツールの欠如のために、HGSCの早期発見は困難なままである。卵管の直接サンプリングは、腫瘍が肉眼で見ることができない場合、腫瘍細胞の検出感度を高めることができる。組織学的所見との良好な相関を示した新鮮な外科的検体から直接に卵管細胞を採取する手順を開発した。このアプローチは、リスクの高い患者集団における低侵襲腹腔鏡検査の将来の有用性の基礎を築く。

概要

卵巣高悪性度漿液癌（HGSC）は、最も一般的で致死的なタイプの卵巣癌であり、依然として公衆衛生上の大きな脅威である。過去10年間で、研究者はHGSC症例の大多数は卵管の代わりに、卵巣自体^{1、2、3、4、5、6}から生じることが示唆されています。漿液性卵管上皮内癌（STIC）が広くHGSC ^{1、7、8、9、10、11}の前駆体として受け入れられています。これまでのところ、卵巣癌の早期発見は困難なままである。癌抗原125（CA-125）と経膣超音波を組み合わせた現在のスクリーニングプロトコールが示されている患者の死亡率^12、13にはほとんど影響。卵巣癌の検出のための子宮内膜標本採取は、極めて低い感度^14を示している。二つの先駆^{15、16は、}良性の卵管の腹腔鏡直接サンプリングの使用を探求し、良性の卵管上皮の細胞学的特徴を特徴研究します。私たちは、卵管からの直接サンプリングもまた、画像化によって腫瘍が可視化されていない初期段階で、STICまたはHGSCを検出するための実用的で直接的な方法であると考えている。

究極の目標は、高リスク因子を有する患者における低侵襲性腹腔鏡下スクリーニングの有用性であるが、現在の研究の即時の目的は、以下である：1）良性卵管上皮のベースライン細胞学的特徴を確立すること。 2）卵巣腺腫の検出における卵管細胞診の感度および特異性を試験することおよび癌前駆体である。そこでHGSC及びその前駆体STIC ¹⁷の検出にこのプロトコルの有効性を試験するために、次のベースラインの卵管細胞学的方法を開発しました。この研究では、定期的に受診した大量の外科用検体を利用し、日常的な手技に加えて外科的に切除したファローピウスチューブの直接サンプリングを行った。

私たちの最近の研究^17は、悪性または悪性腫瘍のための疑いの細胞学的診断は非常にHGSC（100％）の組織学的診断と相関していることを示しました。さらに、卵管の細胞学的評価は、この研究に関与する唯一の2つの組織学的に確認されたSTIC症例において、腫瘍内腫瘍形成を同定した。我々は、卵管細胞診は早期発見において大きな可能性を有し、患者管理に貴重な情報を提供すると考えている。

プロトコル

この研究を実施するため、アリゾナ大学からInstitutional Review Boardの承認を受けた。患者の同意書が得られた。

1.患者の選択

注：機関審査委員会の承認はアリゾナ大学から得られたものである。合計38人の患者が募集された。患者の年齢は32〜86歳で、平均年齢は55歳であり、その内26名は閉経後であり、12名は閉経前であった。

1. 各患者からインフォームドコンセントを得る。

2.ファローピウス管細胞回収手順

注：現在の研究に含まれる患者はすべて、予防的リスク軽減または悪性腫瘍のために、子宮全摘出および両側卵管卵巣摘出術が予定されていた。細胞学的研究を行った病理学者にとって、手術の詳細は不明であった。

1. 手術直後子宮、両側卵巣、両側卵管を含む新鮮な組織標本を注意深く調べて、両側卵管を確認する。
2. 血液をクランプして30分以内に保存液（表の表を参照）に卵管細胞を集めて置く。推奨される防腐剤は、メタノールをベースにした緩衝化保存溶液です。
   注：胸腺細胞の収集には、穏やかなタッチブラシを使用してください（次のステップ）。まれなケースを除いて、卵管が子宮から分離されて提出される場合、卵管筋原線から細胞を収集するためのブラシヘッドを挿入することは、典型的には、卵管が子宮に取り付けられたときに生じる。
   1. 小さな鉗子の助けを借りて、尖端を介して卵管の内腔にブラシ（ 材料の表を参照）を挿入します。ゆっくりと時計回りに回転させ、ブラシを秋の鼻のない部分を通して前方に移動させるオピエンスチューブ、そしてそれが脈状に達するまでアンプル。
   2. ゆっくりとブラシを反時計回りに逆回転させてブラシを引き出します。ルーメン内のブラシの最大速度が1 cm / sより遅いことを確認してください。
   3. 溶液中でブラシを10回回転させて渦巻かせることにより、保存液（バイアル中）でブラシをすすぐ。
   4. バイアルキャップを締めます。
   5. 患者の情報と標本の側面を記録する。
   6. バイアルを4℃の冷蔵庫（最大6ヶ月間）に保管してください。

3.管幹細胞診スライド調製

1. スライドバイアル用のサンプルバイアルを自動化されたプロセッサーにロードします。
   注：我々は、スライドの準備のための自動化されたプロセッサを使用しています。以下のステップは、サンプルバイアルをプロセッサに入れた後に自動的に実行される：（i）サンプル中の試験フィルターの回転によって細胞および残屑が分離および分散されるバイアル。 （ii）管状細胞を、穏やかな真空によってフィルターの外面から収集する。 （iii）フィルターを逆さにしてスライドに押し付け、細胞をスライド内の円形領域に接着させる。 （iv）スライドをさらに細胞固定液に固定し、染色および細胞学分析の準備をする。残念なことに、同様の品質で結果を出すことができる代替手動方法はありません。

4.改変パパニコロウ染色プロトコル

1. 表1に示すように、自動化された非gyn染色手順を実行することによって、ステップ3.1から作製されたスライドを染色する。
   注：染色法は、非婦人科検体に日常的に使用されているパパニコロー染色法の変更を表しています。自動化された組織プロセッサーを使用してスライドを染色します。この研究では、Gyn染色法よりも非Gyn染色法を選択した。使用されるエオシンは、EA-50の代わりにEA-65を使用した婦人科検体（パップスミア検体）。さらに、主に扁平上皮細胞染色のためのGyn染色法におけるOG-6は、この研究では扁平上皮細胞は見られないので染色手順には含まれない。 EA65（Eosin Azure）は、Eosin Y、Fast green FCF、ビスマルクブラウンYの3種類の染料からなるカウンターステイン溶液である。この手順を表1に示す 。
2. 次のように手動の迅速なPap染色手順を実行します。
   1. ステップ3.1で作製したスライドを95％エタノールに10回浸す。各浸漬は約1秒かかる。
   2. スライドをH ₂ Oに10回浸し、各浸漬に約1秒かかる。
   3. スライドをヘマトキシリンで10〜60秒間出現させる。
   4. スライドをH ₂ Oに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
   5. スライドを95％エタノールに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
   6. EA65で1〜3分間スライドを出す。
   7. スライドをディップするinto H ₂ O、10回、各浸漬は約1秒かかる。
   8. スライドを95％エタノールに10回浸漬する。各浸漬は約1秒かかる。
   9. スライドが透明になるまでキシレンでスライドを浸します。
      注：これは改変されたパパニコラウ染色法である。この方法は、現場の細針吸引およびSTAT検体のような時間または空間が限られている場合に、より迅速な染色方法として使用される。この手順は、自動化された非Gyn染色手順と同等の品質の染色を提供する。この手順を表2に示す 。

5.細胞をスライドにスピンさせる

注：各標本に対して3種類のサイトスピンスライドが作成されています。 1つのスライドは、細胞学スライドとの形態学的比較のために染色されたH＆Eである。 2つの染色されていないスライドが、将来のIHC染色研究のために作製された。このセクションの詳細な手順はこのペーパーの焦点では​​ありません。したがって、我々はそれらを拡張dで議論しないetails。

1. 検査されるべき各サンプルについて、標識されたスライド、検体漏斗およびフィルターを備えた細胞遠心分離機を調製する。
2. 200×gで5分間遠心分離することによって細胞を濃縮する。
3. 上清の約半分を取り出し、穏やかなピペッティングで細胞を再懸濁する。
4. 各細胞懸濁液200μLを試料漏斗に加える。
5. 250 xgで5分間スピンします。慎重に細胞遠心分離機からスライドを取り出し、固定のために95％エタノールに移す。
6. 染色の前に空気乾燥し、長期保存してください。
   注：最終スライドのセル密度に応じて、ステップ5.2およびステップ5.3はスキップまたは調整できます。この研究では、適切な細胞密度のために高出力の視野あたり少なくとも2つの細胞クラスターが必要である。

6.浮動端（SEE-FIM）プロトコルのセクション化と広範な検討

1. 検体全体（子宮、両側卵管、卵巣を含む）を固定し、10％ホルマリン中で、剥離を最小限に抑えるために累積する。
2. 静かに、注意深く小さな鉗子とハサミを使用して、狭窄部で子宮から卵管を外す。癒着がある場合は、小さな鉗子とハサミを使用して、卵巣表面から釣り糸の端を慎重に解剖する。これらのステップは、それらの親密な近接のために卵巣と卵管との間の腫瘍の交差汚染を最小にするために重要である。
3. 不全麻痺者および線毛部（卵管の遠位1.0〜2.0cm）を残りの標本から切断する。
4. 2mm間隔で縦横に切開部および線毛部を切る。組織学的検査のためにtotoの全てのセクションを提出する。
5. 2〜3 mm間隔で胸筋と胸部を切開し、完全に提出する。

結果

私たちの以前の研究は、穏やかなタッチブラシを使用して切除された卵管から直接サンプリングすることにより、さらなる細胞学的評価のために定量的および定性的に適切な検体を得ることができることを示した。加えて、自動化されたスライド調製と改変されたパパニコラウ染色との組み合わせにより、病理学者は細胞学的詳細をより正確に視覚化して正確な診断?...

ディスカッション

予防的な両側性卵管摘除術または卵管卵巣摘出術は、BRCA遺伝子突然変異および強力な家族性癌の病歴を有する女性のような高リスク集団においてHGSCを発症する危険性を低下させることが示されている。しかし、手術によって引き起こされる無菌性および外科的閉経は重大な結果であり、特に出産年齢の女性にとっては困難な決定を下す。以前の研究は、卵管細胞診と組織学の間に優れた相?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786