Citologia tubária do tubo de Falópio como uma ferramenta promissora para a detecção precoce do câncer de ovário

Resumo

Nós exploramos um método citológico de trompas por amostragem da trompa de Falópio, diretamente após a cirurgia, como uma ferramenta de detecção precoce de câncer de ovário. Aqui, apresentamos um protocolo para coletar células do tubo de Falópio de espécimes cirúrgicos recém-recebidos.

Resumo

Atualmente, é amplamente aceito que a grande maioria do carcinoma seroso de alto grau ovariano (HGSC) é originário da trompa de Falópio. No entanto, devido à falta de marcadores ou ferramentas para a identificação do câncer de ovário, a detecção precoce do HGSC continua sendo desafiadora. A amostragem direta da trompa de Falópio pode aumentar a sensibilidade para a detecção de células neoplásicas quando o tumor não é visivelmente visível. Desenvolvemos um procedimento para coletar células do tubo de Falópio diretamente dos espécimes cirúrgicos recém-recebidos, o que mostrou excelente correlação com os achados histológicos. Esta abordagem estabelece uma base para a utilidade futura do rastreio laparoscópico minimamente invasivo em populações de pacientes de alto risco.

Introdução

O carcinoma seroso de alto grau de ovário (HGSC) é o tipo de câncer de ovário mais comum e letal e continua sendo uma grande ameaça à saúde pública. Na última década, os pesquisadores sugeriram que a grande maioria dos casos de HGSC surgem da trompa de Falópio em vez do próprio ovário ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . O carcinoma intra-epitelial tubárico seroso (STIC) é amplamente aceito como o precursor de HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Até agora, a detecção precoce do câncer de ovário permanece difícil. O protocolo de rastreio atual com antígeno de câncer combinado 125 (CA-125) e ultra-sonografia transvaginal mostrouPouco efeito sobre a mortalidade dos pacientes ^{12 , 13} . A amostragem endometrial para detecção de câncer de ovário mostrou uma sensibilidade extremamente baixa ¹⁴ . Dois estudos pioneiros ^{15 , 16} exploraram o uso da amostragem direta laparoscópica de trompas de Falópio benignas e caracterizaram as características citológicas do epitélio tubárica benigno. Acreditamos que a amostragem direta da trompa de Falópio também pode ser uma maneira prática e direta de detectar STIC ou HGSC em um estágio inicial quando o tumor não é visualizado por imagem.

Embora o objetivo final seja a utilidade do rastreio laparoscópico minimamente invasivo em pacientes com fatores de alto risco, os objetivos imediatos do presente estudo são: 1) estabelecer as características citológicas basais do epitélio tubáreo benigno; E 2) testar a sensibilidade e especificidade da citologia tubária na detecção de câncer de ovárioPrecursores de câncer e câncer. Desta forma, desenvolvemos o seguinte método basal de citologia tubária para testar a eficácia deste protocolo na detecção de HGSC e seu precursor STIC ¹⁷ . Neste estudo, aproveitamos o grande volume de espécimes cirúrgicos recebidos regularmente e realizamos amostragem direta da trompa de falópio excisada cirurgicamente, além dos procedimentos de cobrança de rotina.

Nosso estudo recente ¹⁷ mostrou que o diagnóstico citológico de malignidade ou suspeita de malignidade está altamente correlacionado com o diagnóstico histológico de HGSC (100%). Além disso, a avaliação citológica tubária identificou neoplasia intratubal nos dois únicos casos de STIC confirmados histologicamente envolvidos neste estudo. Acreditamos que a citologia tubária tem um grande potencial na detecção precoce e proporcionará informações valiosas para o gerenciamento de pacientes.

Protocolo

Foi recebida uma aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade do Arizona para realizar este estudo. Formulários informados de consentimento do paciente foram obtidos.

1. Seleção de Paciente

NOTA: Uma aprovação do Conselho de Revisão Institucional foi obtida da Universidade do Arizona. Um total de 38 pacientes foram recrutados. A idade dos pacientes variou de 32 a 86 anos com uma média de 55 anos, dos quais 26 pacientes pós-menopausa e 12 pacientes pré-menopausa.

1. Obtenha o consentimento informado de cada paciente.

2. Processo de coleção de células de trompa de falópio

NOTA: Os pacientes incluídos no presente estudo foram todos agendados para histerectomia total e salpingo-ooforectomia bilateral para redução de risco profilático ou malignidade. Os detalhes da cirurgia foram desconhecidos para o patologista que realizou o estudo de citologia.

1. Imediatamente após o surgiExcisão térmica, examine cuidadosamente a amostra de tecido fresco incluindo o útero, ovários bilaterais e trompas de falópio bilaterais para identificar a trompa de Falópio bilateral.
2. Recolher e colocar as células do tubo de Falópio no frasco de solução conservante (ver Tabela de Materiais) dentro de 30 minutos de apertar o suprimento de sangue; O conservante recomendado é uma solução de conservante tamponada a base de metanol.
   NOTA: use uma escova de toque suave para a coleção de células tubulares (próximas etapas). Com exceção de casos raros em que a trompa de Falópio é submetida à separação do útero, a inserção de uma cabeça de escova para coletar células da fimbria tubária ocorre tipicamente quando a trompa de Falópio está presa ao útero.
   1. Com a ajuda de uma pequena pinça, insira a escova (ver Tabela de Materiais ) no lúmen da trompa de Falópio através da extremidade das fimbrias. Gire lentamente no sentido horário e mova a escova para a frente através da porção infundibular da quedaTubo opiano, depois a ampola até chegar ao istmo.
   2. Gire lentamente e inverta a escova no sentido anti-horário para puxar a escova. Certifique-se de que a velocidade máxima da escova dentro do lúmen seja mais lenta do que 1 cm / s.
   3. Enxaguar a escova na solução de conservação (em um frasco para injectáveis) girando e girando a escova 10 vezes na solução.
   4. Aperte a tampa do frasco.
   5. Registre a informação do paciente e a lateralidade do espécime.
   6. Armazene o frasco em uma geladeira a 4 ° C (até 6 meses).

3. Preparação da corrediça de citologia tubária

1. Coloque o frasco de amostra no processador automatizado para a preparação do slide.
   NOTA: Usamos o processador automatizado para preparação de slides. As seguintes etapas são realizadas automaticamente após o frasco de amostra ser colocado no processador: (i) As células e detritos são separados e dispersos através da rotação do filtro de teste dentro da amostraFrasco para injectáveis. (Ii) As células tubáricas são coletadas da superfície exterior do filtro por um vácuo suave. (Iii) O filtro é invertido e pressionado contra o slide para permitir que as células adiram à área circular dentro do slide. (Iv) O slide é ainda fixado em um banho fixador celular e pronto para coloração e análise citológica. Infelizmente, não há nenhum método manual alternativo, que pode produzir resultados com uma qualidade similar.

4. Protocolo de coloração de Papanicolaou modificado

1. Mancha as lâminas feitas a partir do passo 3.1, executando o procedimento de manchas automatizado não-gyn, conforme ilustrado na Tabela 1 .
   NOTA: O método de coloração representa uma modificação da técnica de coloração de Papanicolaou que usamos rotineiramente para espécimes não ginecológicos. Usamos um processador de tecido automatizado para manchar alguns slides. Escolhemos o procedimento de coloração não-Gyn sobre o procedimento de coloração de Gyn neste estudo. A Eosina utilizada é EA-65, em vez da EA-50 utilizada paraEspécimes ginecológicos (amostra de Papanicolau). Além disso, o OG-6 no procedimento de coloração de Gyn, que é principalmente para coloração de células escamosas, não está incluído no procedimento de coloração, uma vez que não se espera que as células escamosas sejam vistas neste estudo. EA65 (Eosin Azure) é uma solução de contra-mancha composta por 3 corantes: Eosina Y, Fast FCF verde e Bismarck Brown Y. O procedimento está ilustrado na Tabela 1 .
2. Execute um procedimento rápido manual de manchas de Papa da seguinte maneira.
   1. Dip a corrediça feita no passo 3.1 em etanol a 95%, 10 vezes, com cada mergulho tendo aproximadamente 1 s.
   2. Dip o slide em H ₂ O, 10 vezes, com cada mergulho tendo cerca de 1 s.
   3. Emerge o slide na hematoxilina por 10 a 60 s.
   4. Dip o slide em H ₂ O, 10 vezes, com cada mergulho tendo cerca de 1 s.
   5. Mergulhe o deslizamento em etanol a 95%, 10 vezes, com cada mergulho tomando cerca de 1 s.
   6. Emerge o slide na EA65 por 1 a 3 min.
   7. Dip the slide intO H ₂ O, 10 vezes, com cada mergulho tendo cerca de 1 s.
   8. Mergulhe o deslizamento em etanol a 95%, 10 vezes, com cada mergulho tomando cerca de 1 s.
   9. Dip o slide no xileno até o slide ficar claro.
      NOTA: Este é um procedimento de coloração de Papanicolaou modificado. Este método é usado como um método de mancha mais rápido para casos com tempo ou espaço limitado, como aspiração com agulha fina no local e espécimes STAT. Este procedimento fornece coloração de qualidade comparável como o procedimento automatizado de manchas não-Gyn. O procedimento está ilustrado na Tabela 2 .

5. Spin Cells em slides

NOTA: Três lâminas de cytospin são feitas para cada espécime. Um slide é H & E corado para a comparação morfológica com o slide de citologia. Foram feitas duas lâminas não mantidas para o futuro estudo de coloração com IHC. As etapas detalhadas desta seção não são o foco deste artigo; Portanto, não vamos discuti-los em d prolongadoEtails.

1. Prepare uma citocentrífuga com uma lâmina rotulada, um funil de amostra e um filtro para cada amostra a ser examinada.
2. Concentre as células por centrifugação durante 5 min a 200 x g.
3. Remova cerca de metade do sobrenadante e depois volte a suspender as células por pipetagem suave.
4. Adicione 200 μL de cada suspensão celular a um embutimento de amostra.
5. Girar a 250 xg por 5 min. Retire cuidadosamente o (s) slide (s) da citocentrífuga e transfira-os para 95% de etanol para fixação.
6. Ar seco antes da coloração e para armazenamento a longo prazo.
   NOTA: Dependendo da densidade celular nos slides finais, o passo 5.2 e o passo 5.3 podem ser ignorados ou ajustados. Neste estudo, exigimos pelo menos 2 clusters de células presentes por visão de alta potência para densidade celular adequada.

6. Seção e exame extensivo do protocolo Fim de Fim de Função (SEE-FIM)

1. Corrija todo o espécime (incluindo útero, trompas de falópio e ovários)Em 10% de formalina antes da recarga para minimizar a esfoliação.
2. Descarte suave e cuidadosamente as trompas de Falópio do útero no istmo usando pinças pequenas e uma tesoura. Se a adesão estiver presente, dissecar cuidadosamente a extremidade fimada da superfície do ovário usando pinças pequenas e uma tesoura; Essas etapas são cruciais para minimizar a contaminação cruzada do tumor entre o ovário e o tubo de Falópio devido à sua proximidade íntima.
3. Ampute o segmento de infundíbulo e fimbriae (o distal 1,0 - 2,0 cm de trompa de Falópio) do resto da amostra.
4. Corte o infundíbulo e as fimbrias longitudinalmente a intervalos de 2 mm. Submeta todas as seções em toto para exame histológico.
5. Corte o istmo e a ampola em intervalos de 2 a 3 mm e envie completamente.

Resultados

Nosso estudo anterior mostrou que a amostragem diretamente da trompa de Falópio excisada usando uma escova de toque suave poderia produzir amostras quantitativas e qualitativamente adequadas para avaliação citológica adicional. Além disso, a combinação de preparação automatizada de lâminas e coloração com Papanicolaou modificada permite ao patologista visualizar melhor os detalhes citológicos para fazer um diagnóstico preciso. Um exemplo de uma mancha de papel manual rápid...

Discussão

A salpingectomia bilateral profilática ou a salopingo-ooforectomia demonstraram diminuir o risco de desenvolver HGSC em populações de alto risco, como mulheres com mutações genéticas de BRCA e história de câncer familiar forte. No entanto, a esterilidade e a menopausa cirúrgica causada pela cirurgia são sérias conseqüências e fazem uma decisão difícil, especialmente para mulheres em idade fértil. O estudo anterior mostrou excelente correlação entre citologia tubária e histologia ¹⁷

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786