난소 암 조기 발견을위한 유망한 도구로서의 난관 조영 세포학

요약

저자들은 난소 암 조기 발견 도구로서 난관을 직접 수술 후 절제 한 후 난관 조영술을 시행하여 난소 세포학적인 방법을 연구 하였다. 여기, 우리는 새로받은 수술 표본에서 난관 세포를 수집하는 프로토콜을 제시한다.

초록

현재, 대부분의 난소의 고급 장 액성 암종 (HGSC)이 난관에서 비롯된 것으로 널리 알려져 있습니다. 그러나, 난소 암 식별을위한 마커 또는 도구의 부족으로 인해 HGSC의 조기 발견은 여전히 ​​어려움을 겪고 있습니다. 나팔관을 직접 샘플링하면 종양이 현저하게 보이지 않을 때 신생 세포의 감수성을 높일 수 있습니다. 우리는 신선하게받은 외과 견본에서 직접 난관 세포를 수집하는 절차를 개발했으며, 이는 조직 학적 발견과 우수한 상관 관계가 있음을 보여줍니다. 이 접근법은 위험도가 높은 환자 집단에서 최소 침습 복강경 검사의 미래 유용성을위한 기반을 마련합니다.

서문

난소 암 (HGSC)은 가장 흔하고 치명적인 유형의 난소 암이며 공중 보건에 중요한 위협이됩니다. 지난 10 년, 연구자들은 HGSC 대부분의 경우는 나팔관 대신 난소 자체가 ^{1, 2, 3, 4, 5, 6에서} 발생하는 것을 제안했다. Serous tubal intraepithelial carcinoma (STIC)는 HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} 의 전조로 널리 받아 들여지고 있습니다. 지금까지 난소 암 조기 발견은 여전히 ​​어려운 일입니다. 암 항원 125 (CA-125)와 질식 초음파를 병용 한 현재 스크리닝 프로토콜환자 사망률에 거의 영향을 미치지 않는다 ^{12 , 13} . 난소 암 검출 내막 샘플링은 매우 낮은 감도 ^14을 도시하고있다. 두 선구자 ^{(15, 16)은} 양성 나팔관 복강경 다이렉트 샘플링의 사용을 탐구 양성 나팔관 상피 세포 학적 기능을 특징으로하는 연구. 우리는 종양이 이미징에 의해 시각화되지 않은 초기 단계에서 나팔관으로부터의 직접 샘플링이 또한 STIC 또는 HGSC를 검출하는 실제적이고 직접적인 방법 일 수 있다고 믿습니다.

궁극적 인 목표는 고위험 인자가있는 환자에서 최소 침습적 복강경 검사의 유용성이지만, 현재 연구의 즉각적인 목표는 다음과 같습니다. 1) 양성 난관 상피 세포의 기본 세포 학적 특징을 확립합니다. 2) 난소 췌관 조영술에서 난관 세포 診의 민감도와 특이도를 검사한다.ers 및 암 전구체. 따라서 우리는 HGSC 및 그 전구체 STIC ^17의 검출에서이 프로토콜의 효과를 시험하기 위해 다음과 같은 기본 tubal cytology 방법을 개발했습니다. 이 연구에서, 우리는 정기적으로받은 외과 표본의 큰 볼륨을 활용하고 외과 절제 관의 직접적인 샘플링을 수행 루틴 총 수익을 올리는 절차 이외에.

우리의 최근의 연구 ^(17)는 악성 또는 악성 종양에 대한 의심의 세포 학적 진단이 매우 HGSC (100 %)의 조직 학적 진단과 상관 관계가 있음을 보여 주었다. 또한, 난관 세포학적인 평가는이 연구에 포함 된 조직 학적으로 확증 된 두 가지의 STIC 경우에서만 표피 내 신 생물이 확인되었다. 우리는 난관 세포학이 조기 발견에 큰 가능성을 가지고 있으며 환자 관리에 귀중한 정보를 제공 할 것이라고 믿습니다.

프로토콜

본 연구를 수행 한 애리조나 대학교 (University of Arizona)에서 Institutional Review Board 승인을 받았습니다. 정보에 입각 한 환자 동의서가 획득되었습니다.

1. 환자 선택

참고 : 애리조나 대학교 (University of Arizona)에서 Institutional Review Board 승인을 받았습니다. 총 38 명의 환자가 모집되었다. 환자의 나이는 32 세에서 86 세 사이 였고 평균 55 세였으며 그 중 26 명이 폐경기 였고 12 명은 폐경기 전이었다.

1. 각 환자의 정보에 입각 한 동의를 얻으십시오.

2. 나팔관 세포 수집 절차

참고 : 현재 연구에 포함 된 환자는 모두 예방 적 위험 감소 또는 악성 종양에 대해 총 자궁 적출술 및 양측 난소 난소 절제술을 예정했다. 수술의 세부 사항은 세포학 연구를 수행 한 병리학 자에게는 알려지지 않았다.

1. 수술 직후양측 난소, 양측 난관을 포함한 신생 조직 검체를 신중히 검사하여 양측 난관을 확인하십시오.
2. 혈액 공급을 고정시키는 30 분 이내에 방광 용액 (표 2 참조) 유리 병에 난관 세포를 모으고 배치하십시오. 권장 방부제는 메탄올을 기본으로 한 완충 용액입니다.
   참고 : 관 세포 수집 (다음 단계)에는 부드러운 터치 브러시를 사용하십시오. 드문 경우를 제외하고는 난관을 자궁에서 분리 한 채로 난관 결장에서 세포를 모으기 위해 브러시 헤드를 삽입하면 나팔관이 자궁에 부착 될 때 발생합니다.
   1. 작은 포셉의 도움으로, 필라테스 끝을 통해 나팔관의 루멘에 브러시 ( 재료 표 참조)를 삽입하십시오. 천천히 시계 방향으로 돌리고 브러시를 가을의 우발적 인 부분을 통해 앞으로 움직이십시오opian 관, 그리고 그것이 협부에 도달 할 때까지 ampulla.
   2. 천천히 브러시를 반 시계 방향으로 돌려서 브러시를 꺼냅니다. 루멘 내에서 브러시의 최대 속도가 1cm / s보다 느린 지 확인하십시오.
   3. 솔루션에서 브러시를 10 번 돌리거나 회전시켜 방부제 용액 (바이알)에 브러시를 헹굽니다.
   4. 바이알 캡을 조입니다.
   5. 환자의 정보와 표본의 측면을 기록하십시오.
   6. 유리 병을 4 ° C 냉장고 (최대 6 개월)에 보관하십시오.

3. Tubal 세포학 슬라이드 준비

1. 슬라이드 준비를 위해 샘플 병을 자동 프로세서에로드하십시오.
   참고 : 우리는 슬라이드 준비에 자동화 된 프로세서를 사용합니다. 샘플 바이알을 프로세서에 넣은 후 다음 단계가 자동으로 수행됩니다. (i) 샘플과 테스트 필터의 회전을 통해 셀과 파편이 분리되어 분산됩니다유리 병. (ii) Tubal 세포는 부드러운 진공에 의해 필터의 외부 표면에서 수집됩니다. (iii) 슬라이드 내에서 원형 영역에 세포가 부착되도록 필터를 뒤집어서 슬라이드에 대하여 가압한다. (iv) 슬라이드는 세포 고정 배지에 추가로 고정되고 염색 및 세포학 분석을 위해 준비된다. 불행히도 비슷한 품질의 결과를 얻을 수있는 대체 수동 방법은 없습니다.

4. 수정 된 파파 니콜라 우 염색 프로토콜

1. 표 1 에 나와있는 것처럼 자동화 된 비 gyn 얼룩 절차를 실행하여 단계 3.1에서 만든 슬라이드를 얼룩.
   참고 : 염색법은 우리가 비 부인과 검체에 일상적으로 사용하는 Papanicolaou 염색법의 변형을 나타냅니다. 자동화 된 티슈 프로세서를 사용하여 일부 슬라이드를 얼룩지게합니다. 우리는이 연구에서 Gyn 염색 과정에 대해 Non-Gyn 염색법을 선택했다. Eosin은 EA-65 대신에 EA-65를 사용합니다.부인과 검체 (자궁 경부 세포진 검사). 또한 편평 세포 염색을 주로하는 Gyn 염색법의 OG-6는이 연구에서 편평 세포가 관찰되지 않기 때문에 염색법에 포함되지 않았다. EA65 (Eosin Azure)는 에오신 Y, 패스트 그린 FCF 및 비스마르크 브라운 Y의 3 가지 염료로 구성된 카운터 얼룩 용액입니다. 절차는 표 1에 설명되어 있습니다.
2. 다음과 같이 수동으로 Pap 얼룩 절차를 수행하십시오.
   1. 3.1 단계에서 만든 슬라이드를 95 % 에탄올로 10 회 정도 담그고 각 딥은 약 1 초가 걸립니다.
   2. 슬라이드를 H ₂ O에 10 번 담그고, 각 딥은 약 1 초가 걸린다.
   3. 헤 마톡 실린에서 10 - 60 초 동안 슬라이드를 나 타냅니다.
   4. 슬라이드를 H ₂ O에 10 번 담그고, 각 딥은 약 1 초가 걸린다.
   5. 슬라이드를 95 % 에탄올로 10 회 딥 (dip)하고, 각 딥은 약 1 초가 걸린다.
   6. EA65에서 1 ~ 3 분 동안 슬라이드를 나 타냅니다.
   7. 슬라이드 딥핑 intO ₂ O, 10 회, 각 딥이 약 1 초 걸린다.
   8. 슬라이드를 95 % 에탄올로 10 회 딥 (dip)하고, 각 딥은 약 1 초가 걸린다.
   9. 슬라이드가 투명해질 때까지 크실렌으로 슬라이드를 담그십시오.
      참고 : 이것은 수정 된 Papanicolaou 염색 절차입니다. 이 방법은 현장의 미세 바늘 흡인 및 STAT 표본과 같이 시간이나 공간이 제한된 경우보다 신속한 염색 방법으로 사용됩니다. 이 절차는 자동화 된 Non-Gyn 염색 절차와 유사한 품질의 염색을 제공합니다. 절차는 표 2에 설명되어 있습니다.

5. 슬라이드에 셀 스핀

참고 : 각 시편에 대해 세 개의 cytospin 슬라이드가 만들어집니다. 한 슬라이드는 세포학 슬라이드와 형태학 비교를 위해 스테인드 H & E입니다. 미래의 IHC 염색 연구를 위해 2 개의 염색되지 않은 슬라이드를 만들었습니다. 이 섹션의 세부 단계는이 백서의 초점이 아닙니다. 그러므로, 우리는 연장 된 d에서 그들을 논하지 않을 것이다.etails.

1. 검사 할 각 샘플에 대해 라벨 슬라이드, 표본 깔대기 및 필터가있는 cytocentrifuge를 준비합니다.
2. 200 X g에서 5 분 동안 원심 분리하여 세포를 농축합니다.
3. 뜨는의 약 절반을 제거하고 부드럽게 pipetting하여 세포를 다시 일시 중지합니다.
4. 각 세포 현탁액 200 μL를 표본 깔때기에 넣으십시오.
5. 250 xg에서 5 분간 스핀. 조심스럽게 cytocentrifuge에서 슬라이드를 제거하고 고정을 위해 95 % 에탄올로 옮기십시오.
6. 염색하기 전에 공기를 건조시키고 장기간 보관하십시오.
   참고 : 최종 슬라이드의 셀 밀도에 따라 5.2 및 5.3 단계를 건너 뛰거나 조정할 수 있습니다. 이 연구에서는 적절한 세포 밀도를 위해 고전력보기 당 적어도 2 개의 셀 클러스터가 필요합니다.

6. 첨단 끝 (SEE-FIM) 프로토콜의 섹션 설정 및 광범위 검토

1. 전체 표본을 수정하십시오 (자궁, 양측 난관 및 난소 포함)10 % 포르말린을 사용하여 각질 제거를 최소화합니다.
2. 부드럽게 조심스럽게 작은 집게와 가위를 사용하여 협부에서 자궁으로부터 난관을 분리하십시오. 접착력이있는 경우 작은 포셉과 가위를 사용하여 frightriated 끝을 난소 표면에서 조심스럽게 해부합니다. 이러한 단계는 친밀한 근접성으로 인해 난소와 난관 사이의 종양 교차 오염을 최소화하는 데 중요합니다.
3. Infundibulum과 fimbriae 세그먼트 (나팔관의 원위 1.0 - 2.0cm)를 나머지 표본에서 절개하십시오.
4. 2 mm 간격으로 종아리와 림프절을 절개하십시오. 조직 검사를 위해 toto의 모든 섹션 을 제출하십시오.
5. 지협과 협부를 2 - 3 mm 간격으로 절개하여 전적으로 제출하십시오.

결과

우리의 이전 연구는 부드러운 터치 브러시를 사용하여 절개 된 나팔관에서 직접 샘플링하는 것이 추후의 세포 학적 평가를 위해 양적으로 그리고 질적으로 적절한 표본을 산출 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한 자동 슬라이드 준비와 수정 된 Papanicolaou 염색의 조합은 병리학자가 정확한 진단을 내리기 위해 세포 학적 세부 사항을 더 잘 시각화 할 수있게 해줍니다. 양성...

토론

예방 양안 난관 절제술 또는 난소 난소 절제술은 BRCA 유전자 돌연변이 및 강력한 가족 암 발병이있는 여성과 같은 고위험군에서 HGSC를 개발할 위험을 감소시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 수술로 인한 불임 및 수술 폐경은 심각한 결과이며 특히 가임기 여성에게 어려운 결정을 내립니다. 이전의 연구는 난관 세포학과 조직학 ¹⁷ 사이의 훌륭한 상관 관계를 보여 주었다. 우리?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786