Tubal Cytology фаллопиевой трубки как перспективный инструмент раннего выявления рака яичников

Резюме

Мы исследовали трубный цитологический метод, взяв пробую фаллопиевую трубку непосредственно после хирургического удаления в качестве инструмента раннего выявления рака яичников. Здесь мы представляем протокол для сбора фаллопиевых ячеек из недавно полученных хирургических образцов.

Аннотация

В настоящее время широко признано, что подавляющее большинство яичников с высоким уровнем серозной карциномы (HGSC) происходит из фаллопиевой трубки. Однако из-за отсутствия маркеров или инструментов для идентификации рака яичников раннее выявление HGSC остается сложным. Прямая выборка фаллопиевой трубки может повысить чувствительность к обнаружению неопластических клеток, когда опухоль не является сильно видимой. Мы разработали процедуру сбора фаллопиевых труб непосредственно из недавно полученных хирургических образцов, которая показала отличную корреляцию с гистологическими данными. Этот подход закладывает основу для будущей полезности минимально инвазивного лапароскопического скрининга в группах пациентов с высоким риском.

Введение

Яичная высокосернистая серозная карцинома (HGSC) является наиболее распространенным и смертельным типом рака яичников и остается серьезной угрозой для здоровья населения. В последнее десятилетие исследователи предположили, что подавляющее большинство случаев HGSC возникает из фаллопиевой трубки вместо самого яичника ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Серьезная трубчатая интраэпителиальная карцинома (STIC) широко признана в качестве предшественника HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . До сих пор раннее выявление рака яичников остается сложным. Текущий протокол скрининга с комбинированным антигеном 125 (CA-125) и трансвагинальным ультразвуком показалМало влияет на смертность пациентов ^{12 , 13} . Пробоотборник эндометрия для выявления рака яичников показал чрезвычайно низкую чувствительность ¹⁴ . В двух пионерских исследованиях ^{15 , 16} изучалось использование лапароскопического прямого отбора доброкачественных фаллопиевых труб и характеризовалось цитологическими особенностями доброкачественного трубчатого эпителия. Мы считаем, что прямой выборка из фаллопиевой трубки также может быть практичным и прямым способом обнаружения STIC или HGSC на ранней стадии, когда опухоль не визуализируется путем визуализации.

Хотя конечной целью является использование минимально инвазивного лапароскопического скрининга у пациентов с факторами высокого риска, непосредственными целями текущего исследования являются: 1) установление базовых цитологических признаков доброкачественного трубного эпителия; И 2) проверить чувствительность и специфичность трубной цитологии при выявлении яичникового канцаИ прекурсоров рака. Поэтому мы разработали следующий базовый метод трубной цитологии для проверки эффективности этого протокола при обнаружении HGSC и его предшественника STIC ¹⁷ . В этом исследовании мы воспользовались большим объемом регулярно принимаемых хирургических образцов и провели прямой выборки хирургически вырезанной фаллопиевой трубки в дополнение к рутинным процедурам валоризации.

В нашем недавнем исследовании ^{17 было} показано, что цитологическая диагностика злокачественных новообразований или подозрение на злокачественность сильно коррелирует с гистологическим диагнозом HGSC (100%). Кроме того, трубная цитологическая оценка выявила интратубальную неоплазию только в двух гистологически подтвержденных случаях STIC, участвующих в этом исследовании. Мы считаем, что цитология в трубках имеет большой потенциал в раннем выявлении и предоставит ценную информацию для управления пациентами.

протокол

Для проведения этого исследования из Университета Аризоны был получен одобрение организационного совета. Получены информированные формы согласия пациента.

1. Выбор пациента

ПРИМЕЧАНИЕ. Утверждение Совета по институциональному обзору было получено в Университете штата Аризона. Всего было набрано 38 пациентов. Возраст пациентов варьировался от 32 до 86 лет со средним значением 55 лет, из которых 26 пациентов были постменопаузальными, а 12 пациентов были предклимактерическими.

1. Получите информированное согласие от каждого пациента.

2. Процедура сбора фаллопиевых труб

ПРИМЕЧАНИЕ. Пациенты, включенные в настоящее исследование, были запланированы на общую гистерэктомию и двустороннюю сальпингоофоректомию либо для профилактики, либо для профилактики злокачественных новообразований. Детали операции были неизвестны для патологоанатома, который проводил цитологическое исследование.

1. Сразу после хирургического вмешательстваЧтобы исследовать свежий образец ткани, включая матку, двусторонние яичники и двусторонние фаллопиевы трубы, чтобы определить двустороннюю фаллопиевую трубку.
2. Собирайте и помещайте клетки фаллопиевой трубки в раствор консервирующего раствора (см. Таблицу материалов) в течение 30 минут после зажима крови; Рекомендуемый консервант представляет собой буферный консервирующий раствор на основе метанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте мягкую сенсорную щетку для сбора трубных клеток (предстоящие шаги). За исключением редких случаев, когда фаллопиевая трубка отделяется от матки, вставляя головку щетки для сбора клеток из трубчатой ​​фимбрии, обычно возникает, когда фаллопиевая трубка прикрепляется к матке.
   1. С помощью маленьких щипцов вставьте кисть (см. Таблицу материалов ) в просвет фаллопиевой трубки через конец фимбрии. Медленно вращайте по часовой стрелке и перемещайте кисть вперед через воронкообразную часть паденияОпиумную трубку, затем ампулу, пока она не достигнет перешейка.
   2. Медленно вращайте и поворачивайте щетку против часовой стрелки, чтобы вытащить кисть. Убедитесь, что максимальная скорость щетки в просвете ниже 1 см / с.
   3. Промойте щетку в растворе для консервантов (во флаконе), вращая и закручивая кисть 10 раз в растворе.
   4. Затяните колпачок флакона.
   5. Запишите информацию пациента и латеральность образца.
   6. Храните флакон в холодильнике 4 ° C (до 6 месяцев).

3. Подготовка к цитологии тубальной цитологии

1. Загрузите образец флакона в автоматизированный процессор для подготовки слайдов.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Мы используем автоматизированный процессор для подготовки слайдов. Следующие шаги выполняются автоматически после того, как образец флакона помещается в процессор: (i) Ячейки и обломки разделяются и диспергируются посредством вращения тестового фильтра внутри образцаФлакон. (Ii) Тубальные клетки собираются с внешней поверхности фильтра с помощью нежного вакуума. (Iii) Фильтр перевернут и прижат к предметному стеклу, чтобы клетки могли прилипать к круглой области внутри слайда. (Iv) Скольжение дополнительно фиксируется в фиксирующей ванне и готово к окрашиванию и цитологическому анализу. К сожалению, альтернативного ручного метода нет, что может дать результаты с аналогичным качеством.

4. Измененный протокол окрашивания Papanicolaou

1. Покрасьте слайды, сделанные на шаге 3.1, запустив автоматическую процедуру окрашивания без гина, как показано в таблице 1 .
   ПРИМЕЧАНИЕ. Метод окрашивания представляет собой модификацию метода окрашивания Papanicolaou, который мы обычно используем для негинекологических образцов. Мы используем автоматизированный обработчик ткани для окрашивания некоторых слайдов. В этом исследовании мы выбрали процедуру окрашивания, отличную от Gyn, по методу окраски Gyn. Eosin используется EA-65 вместо EA-50, используемого дляГинекологические образцы (образец мазка Папаниколау). Кроме того, OG-6 в процедуре окрашивания Gyn, которая в основном предназначена для склеивания клеток, не включена в процедуру окрашивания, так как в этом исследовании не ожидается появления плоских клеток. EA65 (Eosin Azure) представляет собой противозадирный раствор, состоящий из 3 красителей: Eosin Y, Fast green FCF и Bismarck brown Y. Процедура проиллюстрирована в таблице 1 .
2. Выполните процедуру быстрого выпаривания пасты вручную следующим образом.
   1. Окуните слайд, сделанный на этапе 3.1, в 95% этанол, в 10 раз, при каждом погружении примерно 1 с.
   2. Окуните слайд в H ₂ O, 10 раз, при каждом погружении около 1 с.
   3. Выпустить слайд в гематоксилин в течение 10-60 с.
   4. Окуните слайд в H ₂ O, 10 раз, при каждом погружении около 1 с.
   5. Окуните слайд в 95% этанол, в 10 раз, при каждом погружении примерно 1 с.
   6. Выпустить слайд в EA65 в течение 1 - 3 мин.
   7. Опустите слайд intO H ₂ O, 10 раз, причем каждый провал занимает около 1 с.
   8. Окуните слайд в 95% этанол, в 10 раз, при каждом погружении примерно 1 с.
   9. Опустите ползунок в ксилоле до тех пор, пока слайд не станет прозрачным.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это модифицированная процедура окрашивания Papanicolaou. Этот метод используется в качестве более быстрого метода окрашивания для случаев с ограниченным временем или пространством, например, на тонкой иглах и образцах STAT на месте. Эта процедура обеспечивает сопоставимое окрашивание качества, как автоматизированная процедура окрашивания Non-Gyn. Процедура проиллюстрирована в таблице 2 .

5. Спин-клетки на слайдах

ПРИМЕЧАНИЕ. Три образца цитоспина предназначены для каждого образца. Один слайд - H & E, окрашенный для морфологического сравнения с цитологическим слайдом. Для будущего исследования окраски IHC были сделаны две неокрашенные слайды. Подробные этапы этого раздела не являются предметом настоящего документа; Поэтому мы не будем обсуждать их в расширенном details.

1. Подготовьте цитоцентрифугу с меченым слайдом, воронкой для образцов и фильтром для каждого исследуемого образца.
2. Концентрируют клетки путем центрифугирования в течение 5 мин при 200 × g.
3. Удалите примерно половину надосадочной жидкости, а затем повторно суспендируйте клетки, осторожно пипетируя.
4. Добавьте 200 мкл каждой клеточной суспензии к воронке образца.
5. Спин при 250 xg в течение 5 мин. Осторожно удалите слайд (ы) из цитоцентрифуги и перенесите их на 95% этанол для фиксации.
6. Воздух сухой до окрашивания и длительного хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от плотности ячейки на конечных слайдах шаг 5.2 и этап 5.3 можно пропустить или отрегулировать. В этом исследовании нам требуется, по меньшей мере, 2 клеточных кластера, присутствующих в режиме высокой мощности, для адекватной плотности клеток.

6. Разделение и широкомасштабная проверка протокола FIMMEDE End (SEE-FIM)

1. Закрепите весь образец (включая матку, двусторонние фаллопиевы трубы и яичники)В 10% формалине до кассового сбора, чтобы минимизировать эксфолиацию.
2. Аккуратно и осторожно отсоедините маточные трубы от матки на перешейке, используя маленькие щипцы и ножницы. Если присутствует адгезия, аккуратно рассекайте фибринный конец с поверхности яичника небольшими щипцами и ножницами; Эти шаги имеют решающее значение для минимизации перекрестного загрязнения опухоли между яичником и фаллопиевой трубкой из-за их непосредственной близости.
3. Ампутировать сегмент воронки и фимбрии (дистальный 1,0 - 2,0 см фаллопиевой трубки) из остальной части образца.
4. Разделите воронку и фимбрий в продольном направлении с интервалом 2 мм. Представьте все разделы в toto для гистологического обследования.
5. Разделите перешеек и ампулу с интервалами 2 - 3 мм и полностью отправьте.

Результаты

Наше предыдущее исследование показало, что выборка непосредственно из иссеченной фаллопиевой трубки с использованием мягкой сенсорной щетки может дать количественный и качественный образец для дальнейшей цитологической оценки. Кроме того, комбинация автоматическ...

Обсуждение

Было показано, что профилактическая двусторонняя сальпингэктомия или сальпингоофоректомия снижает риск развития HGSC в группах высокого риска, таких как женщины с мутациями гена BRCA и сильной семейной историей рака. Тем не менее, бесплодие и хирургическая менопауза, вызванные хирургией...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786