La citología tubárica del tubo de Falopio como herramienta prometedora para la detección temprana del cáncer de ovario

Resumen

Exploramos un método citológico de trompas mediante el muestreo de la trompa de Falopio directamente escisión post-quirúrgica como una herramienta de detección temprana de cáncer de ovario. Aquí, presentamos un protocolo para recoger las células de trompas de Falopio recién recibidos muestras quirúrgicas.

Resumen

Actualmente, es ampliamente aceptado que la gran mayoría de carcinoma seroso de alto grado ovárico (HGSC) se originan de la trompa de Falopio. Sin embargo, debido a la falta de marcadores o herramientas para la identificación del cáncer de ovario, la detección temprana de HGSC sigue siendo un desafío. El muestreo directo de la trompa de Falopio puede aumentar la sensibilidad para la detección de células neoplásicas cuando el tumor no es claramente visible. Se desarrolló un procedimiento para recoger las células de trompas de Falopio directamente de muestras quirúrgicas recién recibidas, lo que ha demostrado una excelente correlación con los hallazgos histológicos. Este enfoque establece una base para la futura utilidad de la exploración laparoscópica mínimamente invasiva en poblaciones de pacientes de alto riesgo.

Introducción

El carcinoma seroso de alto grado ovárico (HGSC) es el tipo más común y letal de cáncer de ovario, y sigue siendo una amenaza importante para la salud pública. En la última década, los investigadores han sugerido que la gran mayoría de los casos de HGSC surgen de la trompa de falopio en lugar del ovario en sí ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . El carcinoma intraepitelial de trompas serosas (STIC) es ampliamente aceptado como el precursor de HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Hasta el momento, la detección temprana del cáncer de ovario sigue siendo difícil. El actual protocolo de selección con antígeno de cáncer combinado 125 (CA-125) y ultrasonido transvaginal ha mostradoPoco efecto sobre la mortalidad de los pacientes ^{12 , 13} . Endometrial muestreo para la detección de cáncer de ovario ha demostrado una sensibilidad extremadamente baja [ ^14] . Dos estudios pioneros ^{15 , 16} exploraron el uso del muestreo directo laparoscópico de trompas de Falopio benignas y caracterizaron las características citológicas del epitelio tubárico benigno. Creemos que el muestreo directo de la trompa de Falopio también puede ser una forma práctica y sencilla de detectar STIC o HGSC en una etapa temprana cuando el tumor no se visualiza mediante imágenes.

Aunque el objetivo final es la utilidad de la exploración laparoscópica mínimamente invasiva en pacientes con factores de alto riesgo, los objetivos inmediatos del presente estudio son: 1) establecer las características citológicas de referencia del epitelio tubárico benigno; Y 2) probar la sensibilidad y especificidad de la citología tubaria en la detección de cáncer de ovarioLos precursores del cáncer. Por lo tanto, desarrolló el siguiente línea base de citología tubaria método para probar la eficacia de este protocolo en la detección de HGSC y su precursor STIC [ ^17] . En este estudio, aprovechamos el gran volumen de muestras quirúrgicas recibidas regularmente, y realizamos muestreo directo de la trompa de Falopio extirpada quirúrgicamente, además de los procedimientos de recaudación sistemática.

Nuestro estudio reciente ¹⁷ mostró que el diagnóstico citológico de malignidad o sospecha de malignidad está altamente correlacionado con el diagnóstico histológico de HGSC (100%). Además, la evaluación citológica tubárica identificó la neoplasia intratubal en los dos únicos histológicamente confirmados STIC casos involucrados en este estudio. Creemos que la citología tubárica tiene un gran potencial en la detección temprana y proporcionará información valiosa para el manejo del paciente.

Protocolo

La Universidad de Arizona recibió una aprobación de la Junta de Revisión Institucional por conducir este estudio. Se obtuvieron formularios de consentimiento informados del paciente.

1. Selección del Paciente

NOTA: Se obtuvo una aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Arizona. Se reclutó un total de 38 pacientes. La edad de los pacientes osciló entre los 32 y los 86 años, con una media de 55 años, de los cuales 26 fueron post-menopáusicas y 12 fueron pre-menopáusicas.

1. Obtenga el consentimiento informado de cada paciente.

2. Procedimiento de recolección de células de trompas de Falopio

NOTA: Los pacientes incluidos en el presente estudio fueron todos programados para histerectomía total y salpingo-ooforectomía bilateral para la reducción del riesgo profiláctico o malignidad. Los detalles de la cirugía eran desconocidos para el patólogo que realizó el estudio de citología.

1. Inmediatamente después del surgiExaminar la muestra de tejido fresco incluyendo el útero, los ovarios bilaterales y las trompas de falopio bilaterales cuidadosamente para identificar la trompa de falopio bilateral.
2. Recoja y coloque las células de las trompas de Falopio en el vial de la solución conservadora (ver Tabla de Materiales) dentro de los 30 minutos de sujeción del suministro de sangre; El conservante recomendado es una solución de conservante tamponada a base de metanol.
   NOTA: Utilice un cepillo suave para la colección de células tubáricas (próximos pasos). Con la excepción de casos raros en los que se somete a la trompa de Falopio desprendida del útero, la inserción de una cabeza de cepillo para recoger las células de la fímbria tubárica ocurre típicamente cuando la trompa de Falopio está unida al útero.
   1. Con la ayuda de una pinza pequeña, inserte el cepillo (ver Tabla de Materiales ) en el lumen de la trompa de falopio a través de la extremidad de las fimbrias. Gire lentamente en el sentido de las agujas del reloj y mueva el cepillo hacia adelante a través de la parte infundibular de la caídaOpio, luego la ampolla hasta llegar al istmo.
   2. Gire lentamente e invierta el cepillo en el sentido contrario a las agujas del reloj para sacar el cepillo. Asegúrese de que la velocidad máxima del cepillo dentro de la luz es más lenta que 1 cm / s.
   3. Enjuague el cepillo en la solución conservante (en un vial) girando y girando el cepillo 10 veces en la solución.
   4. Apriete la tapa del vial.
   5. Registre la información del paciente y la lateralidad de la muestra.
   6. Guarde el vial en un refrigerador de 4 ° C (hasta 6 meses).

3. Preparación de diapositivas de citología tubárica

1. Cargue el vial de muestra en el procesador automatizado para la preparación de diapositivas.
   NOTA: Utilizamos el procesador automatizado para la preparación de diapositivas. Los pasos siguientes se realizan automáticamente después de que el vial de muestra se coloca en el procesador: (i) Las células y los desechos se separan y dispersan a través de la rotación del filtro de prueba dentro de la muestrafrasco. (Ii) Las células tubáricas se recogen de la superficie exterior del filtro mediante un suave vacío. (Iii) El filtro se invierte y se presiona contra la corredera para permitir que las células se adhieran al área circular dentro de la corredera. (Iv) La corredera se fija adicionalmente en un baño fijador de células y está lista para el análisis de tinción y citología. Desafortunadamente, no hay un método manual alternativo, que puede producir resultados con una calidad similar.

4. Protocolo de tinción de Papanicolaou modificado

1. Mancha las diapositivas realizadas desde el paso 3.1 ejecutando el procedimiento automatizado de tinción no gyn, como se ilustra en la Tabla 1 .
   NOTA: El método de tinción representa una modificación de la técnica de tinción de Papanicolaou que usamos habitualmente para especímenes no ginecológicos. Utilizamos un procesador de tejido automatizado para manchar algunas diapositivas. Elegimos el procedimiento de tinción no Gyn sobre el procedimiento de tinción Gyn en este estudio. La Eosina utilizada es EA-65, en lugar de la EA-50 utilizada paraEspecímenes ginecológicos (espécimen de Papanicolau). Además, OG-6 en el procedimiento de tinción Gyn, que es principalmente para la tinción de células escamosas, no se incluye en el procedimiento de tinción ya que no se espera que las células escamosas se ve en este estudio. EA65 (Eosin Azure) es una solución de tinción de contador compuesta de 3 colorantes: Eosina Y, FCF verde rápido y Bismarck marrón Y. El procedimiento se ilustra en la Tabla 1 .
2. Realice un procedimiento manual de tinción rápida de Pap como sigue.
   1. Sumerja la lámina hecha en el paso 3.1 en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   2. Sumerja la lámina en H ₂ O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   3. Emerge la diapositiva en hematoxilina durante 10 - 60 s.
   4. Sumerja la lámina en H ₂ O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   5. Sumerja la diapositiva en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   6. Emerge la diapositiva en EA65 durante 1 - 3 min.
   7. Sumerja la diapositiva intO H $ _₂ $ O, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   8. Sumerja la diapositiva en etanol al 95%, 10 veces, con cada inmersión tomando aproximadamente 1 s.
   9. Sumerja la diapositiva en xileno hasta que la diapositiva se aclare.
      NOTA: Este es un procedimiento de tinción de Papanicolaou modificado. Este método se utiliza como un método de tinción más rápido para casos con tiempo o espacio limitado como aspiración en la aguja fina y muestras STAT. Este procedimiento proporciona tinción de calidad comparable como el procedimiento automatizado de tinción no Gyn. El procedimiento se ilustra en la Tabla 2 .

5. Girar las células sobre las diapositivas

NOTA: Se hacen tres diapositivas de citospin para cada espécimen. Una diapositiva es H & E manchado para la comparación morfológica con la diapositiva citología. Se realizaron dos diapositivas no corregidas para el futuro estudio de tinción con IHC. Los pasos detallados de esta sección no son el foco de este documento; Por lo tanto, no vamos a discutir en extenso dCollares

1. Preparar una citocentrífuga con una diapositiva marcada, un embudo de muestra y un filtro para cada muestra a examinar.
2. Se concentran las células por centrifugación durante 5 min a 200 x g.
3. Retirar aproximadamente la mitad del sobrenadante y luego volver a suspender las células por pipeteado suave.
4. Añadir 200 μl de cada suspensión de células a un embudo de muestra.
5. Girar a 250 xg durante 5 min. Retire con cuidado la (s) lámina (s) de la citocentrífuga y transfiéralas a Etanol al 95% para su fijación.
6. Seque al aire antes de la tinción y para el almacenamiento a largo plazo.
   NOTA: Dependiendo de la densidad celular en las diapositivas finales, el paso 5.2 y el paso 5.3 se pueden omitir o ajustar. En este estudio, se requieren por lo menos 2 grupos de células presentes por alta potencia vista para una densidad celular adecuada.

6. Seccionando y Examinando Extensivamente el Protocolo de Extremo Fimbriado (SEE-FIM)

1. Fijar todo el espécimen (incluyendo el útero, las trompas de Falopio y los ovarios)En formalina al 10% antes de la recaudación bruta para minimizar la exfoliación.
2. Suavemente y cuidadosamente separar las trompas de Falopio del útero en el istmo con una pinza pequeña y una tijeras. Si hay adhesión, disecar cuidadosamente el extremo finiforme de la superficie del ovario con una pinza pequeña y unas tijeras; Estos pasos son cruciales para minimizar la contaminación cruzada tumoral entre el ovario y la trompa de Falopio debido a su proximidad íntima.
3. Amputa el infundíbulo y el segmento de las fimbrias (distal 1.0 - 2.0 cm de la trompa de Falopio) del resto de la muestra.
4. Corte el infundíbulo y las fimbrias longitudinalmente a intervalos de 2 mm. Envíe todas las secciones en toto para el examen histológico.
5. Corte el istmo y la ampolla a intervalos de 2 - 3 mm y someta completamente.

Resultados

Nuestro estudio previo demostró que el muestreo directo de la trompa de Falopio extirpada utilizando un cepillo táctil suave podría producir una muestra cuantitativa y cualitativamente adecuada para una evaluación citológica posterior. Además, la combinación de preparación de diapositivas automatizada y tinción de Papanicolaou modificada permiten al patólogo visualizar mejor los detalles citológicos para realizar un diagnóstico preciso. En la Figura 1

Discusión

Se ha demostrado que la salpingectomía bilateral profiláctica o la salpingo-ooforectomía disminuyen el riesgo de desarrollar HGSC en poblaciones de alto riesgo, como las mujeres con mutaciones genéticas BRCA y una fuerte historia familiar de cáncer. Sin embargo, la esterilidad y la menopausia quirúrgica causada por la cirugía son graves consecuencias y tomar una decisión difícil, especialmente para las mujeres en edad fértil. El estudio anterior ha demostrado una excelente correlación entre la citología tuba...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786