Tubal Cytologia del Tubo Fallopiano come strumento promettente per il rilevamento precoce del cancro ovarico

Riepilogo

Abbiamo esplorato un metodo tubulare citologico campionando il tubo fallopiano direttamente l'escissione post-chirurgica come strumento di rilevazione precoce del cancro ovarico. Qui presentiamo un protocollo per raccogliere le celle di tubo fallopiano da esemplari chirurgici appena ricevuti.

Abstract

Attualmente, è ampiamente accettato che la stragrande maggioranza del carcinoma serico di alta qualità (HGSC) ovarico provengono dal tubo fallopiano. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori o strumenti per l'identificazione del cancro ovarico, il rilevamento precoce di HGSC rimane impegnativo. Il campionamento diretto del tubo fallopiano può aumentare la sensibilità per la rilevazione delle cellule neoplastiche quando il tumore non è grossolanamente visibile. Abbiamo sviluppato una procedura per raccogliere le cellule del tubo fallopiano direttamente dai campioni chirurgici appena ricevuti, che ha dimostrato un'ottima correlazione con i risultati istologici. Questo approccio pone una base per l'utilità futura dello screening laparoscopico minimamente invasivo nelle popolazioni di pazienti ad alto rischio.

Introduzione

Il carcinoma sanguigno di alta qualità ovarico (HGSC) è il tipo più comune e letale del cancro ovarico e rimane una minaccia per la salute pubblica. Negli ultimi dieci anni, i ricercatori hanno suggerito che la grande maggioranza dei casi HGSC provengono dal tubo fallopiano anziché l'ovaia stessa ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Il carcinoma intraepiteliale tubolare serico (STIC) è ampiamente accettato come precursore di HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Finora, l'individuazione precoce del cancro ovarico rimane difficile. Il protocollo di screening attuale con antigene combinato del cancro 125 (CA-125) e ultrasuono transvaginale ha mostratoPoco effetto sulla mortalità paziente ^{12 , 13} . Il campionamento endometriale per il rilevamento del cancro ovarico ha mostrato una sensibilità estremamente bassa ¹⁴ . Due studi pionieristici ^{15 , 16 hanno} esplorato l'utilizzo del campionamento diretto laparoscopico di tubi benigni fallopiani e caratterizzato le caratteristiche citologiche dell'epitelio tubulare benigno. Noi crediamo che il campionamento diretto dal tubo fallopiano può anche essere un modo pratico e semplice per rilevare STIC o HGSC in una fase precoce quando il tumore non è visualizzato dall'immagine.

Sebbene l'obiettivo finale sia l'utilità di uno screening laparoscopico minimamente invasivo in pazienti con fattori ad alto rischio, gli obiettivi immediati dello studio attuale sono: 1) stabilire le caratteristiche citologiche di base dell'epitelio tubulare benigno; E 2) testare la sensibilità e la specificità della citologia tubale nel rilevare la cancellazione ovaricaI precursori del cancro. Abbiamo pertanto sviluppato il seguente metodo di citologia tubolare di base per testare l'efficacia di questo protocollo nel rilevamento di HGSC e del suo precursore STIC ¹⁷ . In questo studio abbiamo approfittato del grande volume di esemplari chirurgici regolarmente ricevuti e abbiamo eseguito un campionamento diretto del tubo fallopiano chirurgicamente espiato in aggiunta alle procedure di incasso di routine.

Il nostro recente studio ^{17 ha} dimostrato che la diagnosi citologica di maligni o sospetti per malignità è altamente correlata con la diagnosi istologica di HGSC (100%). Inoltre, la valutazione citologica tubolare ha identificato la neoplasia intratubale negli unici casi di STIC confermati istologicamente coinvolti in questo studio. Crediamo che la citologia tubale abbia un grande potenziale nel rilevamento precoce e fornisca informazioni preziose per la gestione del paziente.

Protocollo

Un'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ricevuta dall'Università di Arizona per condurre questo studio. Sono state fornite forme di consenso del paziente informato.

1. Selezione del paziente

NOTA: L'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta dall'Università di Arizona. Sono stati reclutati complessivamente 38 pazienti. L'età dei pazienti varia da 32 a 86 anni con una media di 55 anni, di cui 26 pazienti in post-menopausa e 12 pazienti erano pre-menopausa.

1. Ottenere un consenso informato da ogni paziente.

2. Procedura di raccolta delle cellule tubo fallopiane

NOTA: I pazienti inclusi nello studio in corso erano tutti previsti per l'isterectomia totale e la bilaterale salpingo-ooforectomia per la riduzione dei rischi profilattici o la malignità. I dettagli della chirurgia erano sconosciuti per il patologo che ha eseguito lo studio della citologia.

1. Subito dopo surgiEsaminare il campione di tessuto fresco, incluso l'utero, le ovaie bilaterali e i tubi bilaterali fallopiani con attenzione per identificare il tubo bilaterale fallopiano.
2. Raccogliere e collocare le cellule del tubo fallopiano nella soluzione di conservante (vedi tabella dei materiali) entro 30 minuti dalla presa di sangue; Il conservante consigliato è una soluzione conservante a base di metanolo, tamponata.
   NOTA: Utilizzare un pennello di tocco gentile per la raccolta delle celle tubolari (prossimi passi). Ad eccezione dei rari casi in cui il tubo fallopiano viene sottoposto a scomparsa dall'utero, l'inserimento di una testa di pennello per raccogliere le cellule provenienti dalla fimbria tubale si verifica tipicamente quando il tubo fallopiano è attaccato all'utero.
   1. Con l'aiuto di una piccola pinza, inserire la spazzola (vedi tabella dei materiali ) nel lumen del tubo fallopiano attraverso l'estremità del fimbriae. Girare lentamente in senso orario e spostare la spazzola in avanti attraverso la parte infondibolare della cadutaTubo opiano, quindi l'ampolla fino a raggiungere l'istmo.
   2. Ruotare lentamente e invertire la spazzola in senso antiorario per estrarre la spazzola. Assicurarsi che la velocità massima del pennello all'interno del lumen sia inferiore a 1 cm / s.
   3. Sciacquare la spazzola nella soluzione di conservante (in una fiala) ruotando e scorrazzando la spazzola 10 volte nella soluzione.
   4. Serrare il tappo del flaconcino.
   5. Registrare le informazioni del paziente e la lateralità del campione.
   6. Conservare la fiala in un frigorifero a 4 ° C (fino a 6 mesi).

3. Preparazione di Slide Tubal Cytology

1. Caricare la fiala di campionamento nel processore automatizzato per la preparazione delle diapositive.
   NOTA: utilizziamo il processore automatizzato per la preparazione delle diapositive. Le seguenti fasi vengono eseguite automaticamente dopo che il flaconcino di campionamento è posto nel processore: (i) le celle ei detriti sono separati e dispersi attraverso la rotazione del filtro di prova all'interno del campionefiala. (Ii) Le cellule tubali vengono raccolte dalla superficie esterna del filtro con un leggero vuoto. (Iii) Il filtro viene invertito e premuto contro lo scivolo per consentire alle cellule di aderire all'area circolare all'interno della diapositiva. (Iv) Lo scivolo viene ulteriormente fissato in un bagno di fissaggio cellulare e pronto per la colorazione e l'analisi citologica. Purtroppo, non esiste un metodo manuale alternativo, che può produrre risultati con una qualità simile.

4. Protocollo di colorazione Papanicolaou modificato

1. Trattare le diapositive fatte in passaggio 3.1 eseguendo la procedura automatica di macchia non gyn, come illustrato nella tabella 1 .
   NOTA: Il metodo di colorazione rappresenta una modifica della tecnica di colorazione Papanicolaou che usiamo in maniera regolare per esemplari non ginecologici. Utilizziamo un processore di tessuto automatizzato per macchiare alcune diapositive. Abbiamo scelto la procedura di colorazione non-Gyn sulla procedura di colorazione Gyn in questo studio. L'Eosin usato è EA-65, anziché l'EA-50 usato perEsemplari ginecologici (esemplare di Pap test). Inoltre, l'OG-6 nella procedura di colorazione Gyn, che è principalmente per la colorazione delle cellule squamose, non è inclusa nella procedura di colorazione poiché non si prevede che vengano osservate cellule squamose in questo studio. EA65 (Eosin Azure) è una soluzione di contrasto composta da 3 coloranti: Eosin Y, Fast green FCF e Bismarck brown Y. La procedura è illustrata nella Tabella 1 .
2. Eseguire una procedura veloce per Pap pappa manuale come segue.
   1. Immergere la diapositiva fatta nel passaggio 3.1 in etanolo al 95%, 10 volte, con ogni tuffo prendendo circa 1 s.
   2. Immergere la diapositiva in H ₂ O, 10 volte, con ogni tuffo prendendo circa 1 s.
   3. Emerge la diapositiva in ematossilina per 10-60 s.
   4. Immergere la diapositiva in H ₂ O, 10 volte, con ogni tuffo prendendo circa 1 s.
   5. Immergere la slitta in etanolo al 95%, 10 volte, con ogni tuffo prendendo circa 1 s.
   6. Emerge la diapositiva in EA65 per 1 - 3 min.
   7. Immergere la diapositiva intO H ₂ O, 10 volte, con ogni tuffo che dura circa 1 s.
   8. Immergere la slitta in etanolo al 95%, 10 volte, con ogni tuffo prendendo circa 1 s.
   9. Immergere la diapositiva in xilene fino a far scorrere la diapositiva.
      NOTA: Si tratta di una procedura di colorazione Papanicolaou modificata. Questo metodo è usato come un metodo di macchia più veloce per casi con tempo o spazio limitato come l'aspirazione fine del sito in loco e gli esemplari STAT. Questa procedura fornisce una colorazione di qualità comparabile come la procedura automatizzata di macchia non-Gyn. La procedura è illustrata nella Tabella 2 .

5. Spin Cell sulle Slides

NOTA: Per ciascun campione sono fatte tre diapositive di citospina. Una diapositiva è H & E macchiata per il confronto morfologico con la diapositiva di citologia. Due diapositive non sottili sono state fatte per il futuro studio di colorazione IHC. Le fasi dettagliate di questa sezione non sono al centro di questo documento; Pertanto, non li discuteremo in prolungato details.

1. Preparare una citocentrifuga con una diapositiva etichettata, un imbuto del campione e un filtro per ciascun campione da esaminare.
2. Concentrare le cellule centrifugando per 5 min a 200 x g.
3. Rimuovere circa la metà del surnatante e quindi riposizionare le cellule con una pipetta leggera.
4. Aggiungere 200 μL di ogni sospensione cellulare ad un imbuto del campione.
5. Spin a 250 xg per 5 min. Rimuovere con cautela la slitta (i) dalla citocentrifuga e trasferirli al 95% di etanolo per la fissazione.
6. Aria asciutta prima della colorazione e per l'immagazzinamento a lungo termine.
   NOTA: A seconda della densità delle celle sulle diapositive finali, la fase 5.2 e la fase 5.3 possono essere saltati o regolati. In questo studio, abbiamo bisogno di almeno 2 cluster di cellule presenti per vista ad alta potenza per una adeguata densità cellulare.

6. Sezione e esame approfondito del protocollo End Fimbriated (SEE-FIM)

1. Fissare l'intero campione (compreso l'utero, i tubi fallopiani bilaterali e le ovaie)In 10% di formalina prima dell'incasso per minimizzare l'esfoliazione.
2. Separare delicatamente e accuratamente i tubi fallopiani dall'utero all'istmo utilizzando piccole pinze e forbici. Se l'adesione è presente, disseccare attentamente l'estremità fimbriata dalla superficie ovarica utilizzando piccole pinze e forbici; Questi passaggi sono fondamentali per ridurre al minimo la contaminazione tra i tumori della ovaia e del tubo fallopiano dovuta alla loro intima vicinanza.
3. Ampete il segmento infundibulum e fimbriae (il distale 1,0 - 2,0 cm di tubo fallopiano) dal resto del campione.
4. Sezione l'infundibolo e la fimbriae longitudinalmente a intervalli di 2 mm. Invia tutte le sezioni in toto per l'esame istologico.
5. Setta l'istmo e l'ampolla a intervalli da 2 a 3 mm e presentati interamente.

Risultati

Il nostro precedente studio ha mostrato che il campionamento direttamente dal tubo fallopiano uscito con un pennello di tocco gentile potrebbe produrre campioni quantitativamente e qualitativamente adeguati per un'ulteriore valutazione citologica. Inoltre, la combinazione di preparazione automatica di scorrimento e la colorazione Papanicolaou modificata consentono al patologo di visualizzare meglio i dettagli citologici per effettuare una diagnosi accurata. Un esempio di una macchia ...

Discussione

La salpingectomia bilaterale profilattica o il salpingo-ooforectomia ha dimostrato di diminuire il rischio di sviluppare HGSC in popolazioni ad alto rischio, come le donne con mutazioni del gene BRCA e una forte storia familiare del cancro. Tuttavia, la sterilità e la menopausa chirurgica causata dall'intervento chirurgico sono gravi conseguenze e comportano una decisione difficile, soprattutto per le donne in età fertile. Lo studio precedente ha mostrato un'ottima correlazione tra la citologia tubolare e l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786