Tubal-Zytologie der Eileiter als vielversprechendes Werkzeug für Eierstockkrebs Früherkennung

Zusammenfassung

Wir erforschten eine Tubal-Zytologie-Methode durch die Probenahme der Eileiter direkt post-chirurgischen Exzision als ein Werkzeug der Eierstockkrebs Früherkennung. Hier stellen wir ein Protokoll vor, um Eileiterzellen aus frisch erhaltenen chirurgischen Proben zu sammeln.

Zusammenfassung

Derzeit ist es weithin akzeptiert, dass die überwiegende Mehrheit der Ovarien hochgradigen serösen Karzinom (HGSC) aus der Eileiter stammen. Allerdings ist aufgrund der fehlenden Marker oder Werkzeuge für die Eierstockkrebs Identifikation, die Früherkennung von HGSC bleibt herausfordernd. Die direkte Probenahme der Eileiter kann die Empfindlichkeit für den Nachweis von neoplastischen Zellen erhöhen, wenn der Tumor nicht grob sichtbar ist. Wir haben ein Verfahren entwickelt, um Eileiter-Zellen direkt aus frisch erhaltenen chirurgischen Proben zu sammeln, was eine ausgezeichnete Korrelation mit histologischen Befunden gezeigt hat. Dieser Ansatz legt eine Grundlage für den zukünftigen Nutzen des minimal-invasiven laparoskopischen Screenings in Patienten mit hohem Risiko dar.

Einleitung

Eierstock-hochwertiges seröses Karzinom (HGSC) ist die häufigste und tödlichste Art von Eierstockkrebs und bleibt eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit. In den vergangenen zehn Jahren haben Forscher vorgeschlagen, dass die überwiegende Mehrheit der HGSC-Fälle aus dem Eileiter statt der Eierstöcke selbst ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 entstehen} . Seral tubal intraepitheliales Karzinom (STIC) wird weithin als Vorläufer von HGSC ^{1 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} akzeptiert. Bisher ist die frühzeitige Erkennung von Eierstockkrebs schwierig. Das aktuelle Screening-Protokoll mit kombiniertem Krebs-Antigen 125 (CA-125) und transvaginalem Ultraschall hat gezeigtWenig Einfluss auf die Patientensterblichkeit ^{12 , 13} . Die endometriale Probenahme für die Eierstockkrebserkennung zeigte eine extrem niedrige Empfindlichkeit ¹⁴ . Zwei Pionierstudien ^{15 , 16} erforschten die Verwendung der laparoskopischen direkten Probenahme von gutartigen Eileitern und charakterisierten die zytologischen Merkmale des gutartigen Tubalepithels. Wir glauben, dass die direkte Probenahme aus dem Eileiter auch eine praktische und unkomplizierte Möglichkeit ist, STIC oder HGSC frühzeitig zu erkennen, wenn der Tumor nicht durch Bildgebung sichtbar gemacht wird.

Obwohl das ultimative Ziel der Nutzen des minimal-invasiven laparoskopischen Screenings bei Patienten mit hohem Risikofaktor ist, sind die unmittelbaren Ziele der aktuellen Studie: 1) die grundlegenden zytologischen Merkmale von gutartigen tubalen Epithelien zu etablieren; Und 2) Die Empfindlichkeit und Spezifität der Tubalzytologie bei der Erkennung von Eierstockkrebs zu testenUnd Krebsvorläufer. Wir haben daher die folgende Baseline-Tubal-Zytologie-Methode entwickelt, um die Wirksamkeit dieses Protokolls beim Nachweis von HGSC und dessen Vorläufer STIC ¹⁷ zu testen. In dieser Studie nutzten wir das große Volumen der regelmäßig erhaltenen chirurgischen Exemplare und führten eine direkte Probenahme des chirurgisch herausgeschnittenen Eileiters zusätzlich zu den Routine-Einstufungsverfahren durch.

Unsere jüngste Studie ¹⁷ zeigte, dass die zytologische Diagnostik von bösartigen oder Verdachtsfällen gegen Malignität mit der histologischen Diagnose von HGSC (100%) stark korreliert ist. Darüber hinaus identifizierte die tubale zytologische Untersuchung intratubale Neoplasien in den nur zwei histologisch bestätigten STIC-Fällen, die an dieser Studie beteiligt waren. Wir glauben, dass die tubale Zytologie ein großes Potenzial in der Früherkennung hat und wertvolle Informationen für die Patientenverwaltung liefert.

Protokoll

Eine institutionelle Überprüfung Board Genehmigung wurde von der Universität von Arizona für die Durchführung dieser Studie erhalten. Informierte Patientenzusatzungen wurden erhalten.

1. Patientenauswahl

ANMERKUNG: Eine Zustimmung des institutionellen Prüfungsausschusses wurde von der Universität von Arizona erhalten. Insgesamt wurden 38 Patienten rekrutiert. Das Alter der Patienten reichte von 32 bis 86 Jahren mit einem Mittelwert von 55 Jahren, von denen 26 Patienten nach der Menopause waren und 12 Patienten vor der Menopause waren.

1. Erhalten Sie eine informierte Zustimmung von jedem Patienten.

2. Fallopian Tube Cells Collection Vorgehensweise

HINWEIS: Die Patienten, die in die aktuelle Studie aufgenommen wurden, waren alle für die gesamte Hysterektomie und die bilaterale Salpingo-Oophorektomie entweder für die prophylaktische Risikoreduktion oder die Malignität vorgesehen. Die Details der Chirurgie waren unbekannt für Pathologe, der die Zytologie Studie durchgeführt.

1. Unmittelbar nach surgiCal Exzision, untersuchen die frische Gewebe Probe einschließlich Uterus, bilateralen Eierstöcke und bilateralen Eileitern sorgfältig, um die bilaterale Eileiter zu identifizieren.
2. Sammeln und legen Sie Eileiter-Zellen in die Konservierungslösung (siehe Tabelle der Materialien) Durchstechflasche innerhalb von 30 min Klemmen der Blutversorgung; Das empfohlene Konservierungsmittel ist eine auf Methanol basierende, gepufferte Konservierungslösung.
   HINWEIS: Verwenden Sie eine sanfte Berührungsbürste für die Tubalzellsammlung (bevorstehende Schritte). Mit Ausnahme von seltenen Fällen, in denen das Eileiter von der Gebärmutter abgetrennt wird, führt das Einsetzen eines Bürstenkopfes, um Zellen aus dem Tubal Fimbria zu sammeln, typischerweise, wenn das Eileiter an den Uterus gebunden ist.
   1. Mit Hilfe einer kleinen Pinzette die Bürste (siehe Tabelle der Materialien ) in das Lumen des Eileiters durch das Fimbrienende einführen. Langsam im Uhrzeigersinn drehen und die Bürste nach vorne durch den infundibulären Teil des Sturzes bewegenOpian Rohr, dann die Ampulle bis es die Landenge erreicht.
   2. Langsam drehen und die Bürste gegen den Uhrzeigersinn umkehren, um die Bürste herauszuziehen. Stellen Sie sicher, dass die maximale Geschwindigkeit der Bürste im Lumen langsamer als 1 cm / s ist.
   3. Spülen Sie die Bürste in die Konservierungslösung (in einer Durchstechflasche), indem Sie die Bürste 10 Mal in der Lösung drehen und wirbeln.
   4. Ziehen Sie die Fläschchenkappe fest.
   5. Notieren Sie die Informationen des Patienten und die Lateralität des Exemplars.
   6. Die Durchstechflasche in einem 4 ° C-Kühlschrank (bis zu) 6 Monate aufbewahren.

3. Tubal Cytology Slide Vorbereitung

1. Legen Sie die Probenfläschchen in den automatisierten Prozessor für die Folienvorbereitung ein.
   HINWEIS: Wir verwenden den automatisierten Prozessor für die Folienvorbereitung. Die folgenden Schritte werden automatisch durchgeführt, nachdem die Probenampulle in den Prozessor gelegt wurde: (i) Die Zellen und Trümmer werden durch die Rotation des Testfilters innerhalb der Probe getrennt und dispergiertPhiole. (Ii) Tubalzellen werden von der äußeren Oberfläche des Filters durch ein sanftes Vakuum gesammelt. (Iii) Der Filter wird umgekehrt und gegen den Schlitten gedrückt, um die Zellen an den kreisförmigen Bereich innerhalb der Folie zu haften. (Iv) Die Folie wird weiter in einem Zellfixierbad fixiert und bereit zur Färbung und Zytologieanalyse. Leider gibt es keine alternative manuelle Methode, die Ergebnisse mit einer ähnlichen Qualität liefern kann.

4. Modifiziertes Papanicolaou-Färbeprotokoll

1. Färben Sie die Folien aus Schritt 3.1, indem Sie die automatisierte Nicht-Gyn-Fleck-Prozedur ausführen, wie in Tabelle 1 dargestellt .
   HINWEIS: Die Färbemethode stellt eine Modifikation der Papanicolaou-Färbetechnik dar, die wir routinemäßig für nicht-gynäkologische Proben verwenden. Wir verwenden einen automatisierten Gewebeprozessor, um einige Dias zu färben. Wir wählten das Non-Gyn-Färbeverfahren über das Gyn-Färbeverfahren in dieser Studie. Der verwendete Eosin ist EA-65, anstatt der EA-50 verwendetGynäkologische Exemplare (Pap-Abstrichprobe). Darüber hinaus ist OG-6 im Gyn-Färbeverfahren, das hauptsächlich für Plattenepithel-Färbung ist, nicht in das Färbeverfahren eingeschlossen, da keine Plattenepithelzellen in dieser Studie zu sehen sind. EA65 (Eosin Azure) ist eine Gegenflecklösung aus 3 Farbstoffen: Eosin Y, Fast Green FCF und Bismarck Brown Y. Das Verfahren ist in Tabelle 1 dargestellt .
2. Führen Sie eine manuelle schnelle Pap-Fleck-Prozedur wie folgt durch.
   1. Tauchen Sie die Folie in Schritt 3.1 in 95% Ethanol, 10-mal, mit jedem Dip nehmen etwa 1 s.
   2. Tauchen Sie die Folie in H ₂ O, 10-mal, mit jedem Dip nehmen etwa 1 s.
   3. Eidgen Sie die Folie in Hämatoxylin für 10 - 60 s.
   4. Tauchen Sie die Folie in H ₂ O, 10-mal, mit jedem Dip nehmen etwa 1 s.
   5. Tauchen Sie die Folie in 95% Ethanol, 10-mal, mit jedem Dip nehmen etwa 1 s.
   6. Tauchen Sie die Folie in EA65 für 1 - 3 min.
   7. Dip die Folie intO H ₂ O, 10 mal, wobei jeder Tauchgang etwa 1 s dauert.
   8. Tauchen Sie die Folie in 95% Ethanol, 10-mal, mit jedem Dip nehmen etwa 1 s.
   9. Tauchen Sie die Folie in Xylol, bis die Folie klar wird.
      HINWEIS: Dies ist ein modifiziertes Papanicolaou-Färbeverfahren. Diese Methode wird als eine schnellere Fleck-Methode für Fälle mit begrenzter Zeit oder Raum wie vor Ort feine Nadel Aspiration und STAT Proben verwendet. Dieses Verfahren liefert eine vergleichbare Qualitätsfärbung als automatisiertes Non-Gyn-Fleckverfahren. Das Verfahren ist in Tabelle 2 dargestellt .

5. Spin Cells auf Slides

HINWEIS: Für jede Probe werden drei Zytospin-Folien hergestellt. Eine Folie ist H & E gefärbt für den morphologischen Vergleich mit der Zytologie Folie. Zwei ungefärbte Folien wurden für die zukünftige IHC-Färbestudie gemacht. Die ausführlichen Schritte dieses Abschnitts stehen nicht im Mittelpunkt dieses Aufsatzes. Daher werden wir sie nicht in erweiterten d diskutierenEtails

1. Eine Zytocentrifuge mit einer markierten Folie, einem Probentrichter und einem Filter für jede zu untersuchende Probe vorbereiten.
2. Konzentrieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 5 min bei 200 x g.
3. Entfernen Sie etwa die Hälfte des Überstandes und setzen Sie die Zellen dann durch sanftes Pipettieren wieder auf.
4. Füge 200 μl jeder Zellsuspension zu einem Probentrichter hinzu.
5. Spin bei 250 xg für 5 min. Die Folie (n) vorsichtig aus der Zytokentrifuge entfernen und auf 95% Ethanol zur Fixierung überführen.
6. Luft trocknen vor der Färbung und für die Langzeitlagerung.
   HINWEIS: Abhängig von der Zelldichte auf den Endfolien können Schritt 5.2 und Schritt 5.3 übersprungen oder angepasst werden. In dieser Studie benötigen wir mindestens 2 Zellcluster, die pro Hochleistungsansicht für eine ausreichende Zelldichte vorhanden sind.

6. Sektion und umfangreiche Prüfung des Fimbriated End (SEE-FIM) Protokolls

1. Fix das gesamte Exemplar (einschließlich Uterus, bilaterale Eileiter und Eierstöcke)In 10% Formalin vor dem Einbringen, um das Peeling zu minimieren.
2. Die Eileiter von der Gebärmutter an der Landenge sanft und vorsichtig mit kleinen Pinzetten und einer Schere lösen. Wenn die Adhäsion vorhanden ist, zerlegen Sie das fimbrierte Ende sorgfältig von der Eierstockoberfläche mit einer kleinen Pinzette und einer Schere; Diese Schritte sind entscheidend für die Minimierung der Tumor-Kreuz-Kontamination zwischen Eierstock und Eileiter aufgrund ihrer intimen Nähe.
3. Amputieren Sie das Infundibulum und Fimbriae Segment (die distalen 1,0 - 2,0 cm Eileiter) aus dem Rest der Probe.
4. Sektion das Infundibulum und Fimbrien in Längsrichtung in 2-mm-Intervallen. Senden Sie alle Abschnitte in toto für histologische Untersuchung.
5. Sektion der Isthmus und Ampulle in 2 - 3 mm Intervallen und ganz unterschreiben.

Ergebnisse

Unsere bisherige Studie zeigte, dass die Probenahme direkt aus dem herausgeschnittenen Eileiter mit einer sanften Berührungsbürste quantitativ und qualitativ ausreichende Proben für eine weitere zytologische Untersuchung liefern konnte. Darüber hinaus ermöglicht die Kombination von automatischer Folienpräparation und modifizierter Papanicolaou-Färbung dem Pathologen, die zytologischen Details besser zu visualisieren, um eine genaue Diagnose zu machen. Ein Beispiel für einen manue...

Diskussion

Prophylaktische bilaterale Salpingektomie oder Salpingo-Oophorektomie hat gezeigt, dass das Risiko der Entwicklung von HGSC in Hochrisikopopulationen, wie Frauen mit BRCA-Gen-Mutationen und starke familiäre Krebs-Geschichte zu verringern. Allerdings sind die Sterilität und chirurgische Menopause durch die Chirurgie verursacht ernsthafte Konsequenzen und machen für eine schwierige Entscheidung, vor allem für Frauen im gebärfähigen Alter. Die bisherige Studie hat eine ausgezeichnete Korrelation zwischen Tubuszytolog...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cytobrush plus GT gentle touch of Medscand sample collection kit	CooperSurgical	C0112
ThinPrep preservCyt solution	HOLOGIC	234005
ThinPrep 2000 Processor	HOLOGIC	70031-001
Papanicolaou Stain, EA 65	sigma aldrich	HT40432
95% Ethanol	sigma aldrich	652261
100% Ethanol	sigma aldrich	493538
Xylene	sigma aldrich	214736
Hematoxylin	sigma aldrich	H9627
Sakura Tissue Tek 2000 tissue processor	SAKURA	TISSUE-TEK VIP 2000
Mayo Dissecting Scissors,5.5 straight	Pilgrim medical equiment	FA710-45
Chemware Forceps	United state plastic corp	76122
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades,short	SAKURA	4785
Tissue-Tek Accu-Edge Trimming blades handle,short	SAKURA	4786