في فيفو التصوير المتعدد الوسائط، وتحليل للماوس المستحثة بالليزر طراز نيوفاسكولاريزيشن تشورويدال

Summary

نقدم هنا، فائدة التصوير الطولي في فيفو في متابعة التغييرات الشكلية من neovascularization تشورويدال المستحثة بالليزر في الفئران.

Abstract

Neovascularization تشورويدال المستحثة بالليزر (المسيحي) نموذج راسخة لتقليد النموذج الرطب لكبر السن البقعي (AMD). في هذا البروتوكول، ونحن نهدف إلى توجيه القارئ ليس ببساطة من خلال الاعتبارات التقنية لتوليد آفات المستحثة بالليزر لتحريك عمليات نيوفاسكولار، ولكن بدلاً من التركيز على المعلومات القوية التي يمكن الحصول عليها من الطولية النقل المتعدد الوسائط المجراة في التصوير طوال فترة المتابعة.

الماوس المستحثة بالليزر النموذجي الذي تم إنشاؤها بواسطة إقامة ليزر صمام ثنائي. واستخدمت تقنيات التصوير المتعدد الوسائط في فيفو لرصد التعريفي المسيحي والتقدم والتراجع. أولاً، أنجز التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي (SD--أكتوبر) فورا بعد اللايزر للتحقق من فاصل غشاء بروخ في. وأكد اللاحقة في فيفو التصوير باستخدام الأوعية فلوريسسين (اتحاد كرة القدم) الضرر ناجحة من غشاء بروخ لمن صور المسلسل المكتسبة على مستوى تشورويدال. متابعة طولية من الانتشار المسيحي والانحدار في أيام 5 و 10 و 14 بعد اللايزر أجرى باستخدام كل من التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر واتحاد كرة القدم. ويرد بسيطة وموثوق بها الدرجات من راشح المسيحي ليسيونس من الصور اتحاد كرة القدم. التجزئة التلقائية لقياس مجموع سمك الشبكية، جنبا إلى جنب مع تطبيق عيار يدوي لقياس سماكة الشبكية في مواقع متعددة، والسماح بتقييم غير متحيز لوجود وذمة. وأخيراً، النسيجي التحقق من الذي تتم باستخدام تلطيخ إيسوليكتين GS-IB4 على فلاتمونتس تشورويدال. تلطيخ ثريشولديد، ومنطقة إيسوليكتين-إيجابيا يحسب مع إيماجيج.

هذا البروتوكول مفيدة بشكل خاص في دراسات المداواة التي تتطلب عالية-الإنتاجية-مثل الفحص الباثولوجي المسيحي أنها تتيح سرعة، متعدد الوسائط، وتصنيف موثوق بها ذمة الشبكية وأمراض متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، تمكن عالية الدقة التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر تسجيل بصمات المرضية الأخرى، مثل تراكم السوائل سوبريتينال أو إينتراريتينال. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا يوفر إمكانية أتمتة تحليل حجم المسيحي من صور التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، الذي يجب أن تتم يدوياً.

Introduction

أول محاولة ناجحة لتقليد علم الأمراض البشرية المسيحي في القوارض اتضح منذ ثلاثة عقود تقريبا مع ليزر كريبتون في لونغ-إيفانز الفئران¹. وبعد ذلك، استخدمت ليزر كريبتون لكسر غشاء بروخ لسلالة الماوس الأكثر شعبية، C57BL/6J^2،،من³⁴. تم التحقق من معدل نجاح الاستقراء متعددة مع اتحاد كرة القدم والبقع النسيجي. تطور سريع لأساليب التصوير موسع، مثل OCT، عزز نمو مجال القوارض نماذج الإكلينيكية. القدرة على رصد التغييرات الشكلية في الشبكية في نقاط زمنية متعددة في العين نفسها إلى حد كبير يسهم في الحد استخدام الحيوانات، وزيادة الكفاءة في الدراسات التجريبية. التقييم النسيجي لآفات متعددة بدلاً من ذلك واضحة، ويتطلب وضع العلامات لنمو الأوعية الدموية غير طبيعي حول الموقع الإدارة الليزر، والحصول على الصور، وتقدير مساحة/وحدة التخزين باستخدام برنامج تحليل صورة. وفي المقابل، يعرض في فيفو طرائق التصوير تحاليل أكثر تعقيداً من أمراض متعددة وتفسيرها.

هنا نقدم طريقة بسيطة وسريعة نسبيا للصف التعريفي، والتدرج، والانحدار الذي استخدام FA، SD--أكتوبر، والأسلوب الآلي تجزئة في الماوس الليزر المستحثة المسيحي النموذجي.

Protocol

جميع الحيوانات يعاملون وفقا "بيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك والبحث الرؤية "توجيه الجماعة الأوروبية" 86/609/EEC للتجارب على الحيوانات، باستخدام البروتوكولات المعتمدة ويرصدها المجلس تجربة الحيوان في "فنلندا".

1-المستحثة بالليزر الماوس المسيحي نموذج ⁵

1. فحص عيون الحيوان الميكروسكوب لأي شذوذ.
2. وزن الماوس.
3. حساب وإعداد مبلغ مناسب للمسكنات لاستخدام، استناداً إلى وزن الحيوان، مثل خليط من الماء المقطر (محلول كلوريد الصوديوم 0.9%) بنسبة 1:1.5:2.5، أو الكيتامين (40-75 مغ/كغ)، ميديتوميديني (1 مغ/كغ) والكيتامين (75 ملغ/كغ) إكسيلازيني (5 ملغ/كغ)، والماء المقطر (محلول كلوريد الصوديوم 0.9%) بنسبة 5:1؛ 1:2. ماوس ز 20، حقن 0.1 مل مخلوط.
4. حقن مخدر إينترابيريتونيلي.
5. ضع الماوس مرة أخرى إلى القفص وانتظر حتى يتم تخديره من الحيوان. تأكيد هو تخديره الماوس بشكل صحيح بسبب الافتقار إلى منعكس الدواسة.
6. ضمان استخدام الليزر سلامة معدات الحماية الشخصية.
7. قم بتشغيل مصباح شق وليزر صمام ثنائي 532 نانومتر.
8. إزالة الماوس من القفص والمكان على منصة التدفئة.
9. تطبيق قطره واحدة من تروبيكاميدي لتمدد الحدقة. الانتظار لمدة 3-5 دقيقة لتمدد الحدقة الكاملة (3 مم).
10. ضع الماوس على المسرح مصباح الشق.
11. ضع قطره واحدة من جل السائل أوبثالميك على ساترة إلى أبلاناتي القرنية.
12. توجيه العين الماوس مع رأس العصب البصري في المركز.
13. تعيين السلطة الليزر إلى 100 ميغاواط، والمدة إلى 100 مللي ثانية، وحجم البقعة إلى 50 ميكرومتر.
14. وتركز شعاع الليزر على ظهارة صباغ الشبكية (RPE).
15. جعل ثلاث طلقات الليزر إلى عين واحدة عن طريق تجنب الأوعية الدموية الشبكية في موقع مثالي في 4 و 8 و 12:00 م مواقع حول العصب البصري، على التوالي. فحص قاع العين بعد كل الليزر لقطات لعدم وجود نزيف الشبكية. العين كونترالاتيرال بمثابة عنصر تحكم غير lasered.
16. تجاهل الماوس ساترة والمكان مرة أخرى على منصة التدفئة.
17. تطبيق قطره واحدة من قطرات جل شماعة في كلتا العينين.

2-التنمية المستدامة-OCT ^6،7

1. ضع الماوس في مرحلة المحاذاة القوارض، وشل الرأس.
2. قم بمحاذاة العدسة منظومة التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر (مثلاً، R2200 انفيسو بيوبتيجين/إيكا) لمواجهة العين للتصوير في فيفو باستخدام وحدات تحكم المرحلة X و Y.
3. إجراء مسح SD، تشرين الأول/أكتوبر للتحقق من فواصل غشاء بروخ في: مجرد SD-OCT فحص العين كله، يدوياً نقل خط مرجعي في مواقع لاسيريد. فواصل غشاء بروخ في ينبغي أن تكون واضحة للعيان في المناطق lasered (انظر الشكل 1).

3-فلوريسسين الأوعية ^7،،من⁸⁹

1. إزالة الماوس مع الحامل، ووضعه على نظام اتحاد كرة القدم (مثلاً، هايدلبرغ سبيكتراليس HRA2).
2. التركيز على الليزر حرق مناطق قاع العين باستخدام طريقة انعكاس الأشعة تحت الحمراء مع رأس العصب البصري في منتصف نافذة عرض.
3. حقن 0.1 مل ملح الصوديوم فلوريسسين 5% لماوس ز 20 تحت الجلد أو إينترابيريتونيلي.
4. وتركز على مستوى تشورويدال.
5. التقاط صورة من مستوى التركيز تشورويدال.
6. إعادة التركيز على مستوى الشبكية وتأخذ صورة.
7. انتظر 30 ثانية وكرر الخطوات 3، 3، 4-6.
8. إزالة الماوس من الحامل ووضعه على منصة التدفئة.
9. عكس التخدير بخصم α2 ميديتوميديني، أتيباميزولي (0.5 ملغ/كغ، والقائمة)، أو الانتظار لاستعادة الحيوانات من التخدير.
10. كرر في فيفو SD، تشرين الأول/أكتوبر، واتحاد كرة القدم التصوير في تخديره من الحيوانات في متابعة أيام 5 و 10 و 14.

4. متعددة الدرجات

1. درجة ضرر غشاء بروخ لمن أكتوبر والصور تشورويدال FA اتخاذها فورا بعد اللايزر في اليوم 0 كما يلي:
   0--غشاء بروخ لعدم تضرر
   1-نجاح تلف غشاء بروخ
2. الصف وجود المسيحي من البقع lasered كان التسرب كما لوحظ بمقارنة ديناميات إشارة فلوريسسين في سلسلة من الصور فا الشبكية كما يلي:
   0--المظهر الطبيعي لشبكية العين
   تلوين باهتة 0.5-التسرب
   1.0-راشح متعددة المجالات
   ملاحظة: استخدام التصوير أكتوبر لتأكيد إضافية متعددة أو في كرة القدم مشكوك فيها حيث يوحي وجود السوائل إينتراريتينال في أكتوبر صور متعددة الدرجات.

5-قياسات سمك الشبكية

1. استخدام برمجيات تجزئة تلقائية لقياسات سمك الشبكية. التأكد من أن يعتبر سمك الشبكية الكلي، كسمك كل الطبقات من طبقة الألياف العصبية RPE (مواقع القياس الصحي)، أو بخط وهمي يربط RPE المحيطة بموقع الضرر (lasered المواقع) (انظر الشكل 7).

النتائج

فقاعة أو سوبريتينال النزيف فورا بعد اللايزر غير مرئي دائماً. ولذلك، أهمية خاصة للتحقق من الأضرار لغشاء بروخ في SD، تشرين الأول/أكتوبر. ويبين الشكل 1 مثال على تصوير أكتوبر عند نقاط زمنية مختلفة بعد الليزر.

Discussion

ويقدم التصوير المتعدد الوسائط أدوات قيمة لتقييم أمراض متعددة. وقد عرضنا هنا بروتوكولا تصوير تتألف من اتحاد كرة القدم، التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، وتجزئة التلقائي للتقييم السريع واستنساخه، وموثوق بها من أمراض متعددة. فاصل غشاء بروخ في بعد أن أكدت الإدارة الليزر. وباﻹضافة إلى ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine (commercial name Domitor)	Orion	Vnr 01 56 02	Anesthesia
Ketamine	Intervet	Vnr 51 14 85	Anesthesia
0,9% NaCl	B Braun	357 0340	Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet)	Bayer	vnr 14 89 99	Anesthesia
Tropicamide	Santen	Vnr 04 12 36	Mydriatic agent
Viscotears	Alcon	Vnr 44 54 81	Lubricant
Systane	Alcon	-	Lubricant
5% Fluorescein sodium salt	Sigma Aldrich	F6377-100G	Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan)	Orion	Vnr 47 19 53	Anesthesia