Vivo에서 복합 이미징 및 마우스 레이저 유도 안 Neovascularization 모델의 분석

요약

여기, 선물이 쥐에서 안 neovascularization 레이저 유도의 형태학 변화의 후속에서 경도 vivo에서 화상의 유용성.

초록

레이저 유도 안 neovascularization (CNV) 나이 관련 황 반 변성 (AMD)의 습식 모방을 잘 설립 모델입니다. 이 프로토콜에서 우리는 신생 프로세스, 하지만 오히려 multimodal 경도 에서에서 얻을 수 있는 강력한 정보에 초점을 방 아 쇠를 단순히 병 변 레이저 유도 생성의 기술적 고려 사항 통해 독자를 안내 하고자 vivo에서 후속 기간에 걸쳐 이미징.

레이저 유도 마우스 CNV 모델 다이오드 레이저 관리에 의해 생성 되었습니다. 이미징 기술은 복합 vivo에서 CNV 유도, 진행 및 회귀를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 첫 번째, 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 확인 Bruch의 막의 휴식 lasering 즉시 수행 했다. 후속 vivo에서 이미징 fluorescein angiography (FA)를 사용 하 여 직렬 이미지 안 수준에서 인수에서 Bruch의 막의 성공적인 손상 확인. CNV 확산 및 회귀는 lasering 후 5, 10, 및 14 일에의 경도 후속 SD 10 월 및 FA를 사용 하 여 수행 되었다. 간단 하 고 신뢰할 수 있는 FA 이미지에서 새 CNV leasions의 등급 표시 됩니다. CNV 사이트에서 망막 두께의 측정에 대 한 수동 구경 응용 프로그램과 결합 하는 총 망막 두께의 측정에 대 한 자동화 된 세분화 종의 존재의 중 정한 평가 하실 수 있습니다. 마지막으로, CNV의 조직학 확인 isolectin GS-IB4 안 flatmounts에 얼룩을 사용 하 여 수행 됩니다. 얼룩이 지는 thresholded, 그리고 isolectin-긍정적인 지역 ImageJ로 계산 됩니다.

이 프로토콜은 특히 복합, 빨리, 수 CNV 병리학의 높은 처리량 같은 심사를 요구 하는 치료제 연구 및 CNV 병리학과 망막 부 종의 신뢰할 수 있는 분류에 유용 합니다. 또한, 높은 해상도 SD 10 월 subretinal 또는 intraretinal 액체의 축적 등 다른 병 적인 특징의 녹음 수 있습니다. 그러나,이 메서드는 수동으로 수행 하는 SD 10 월 이미지, CNV 볼륨 분석을 자동화 하는 가능성을 제공 하지 않습니다.

서문

최초의 성공적인 시도가 설치류에 인간의 CNV의 병 리를 모방 긴 에반스 쥐¹크립 톤 레이저와 거의 3 년 전을 시연 했다. 그 후, 크립 톤 레이저는 가장 인기 있는 마우스 스트레인, C57BL/6J^2,,34에 Bruch의 멤브레인을 끊는 데 사용 됩니다. CNV 유도 FA와 조직학 얼룩 확인 했습니다. 10 월, 같은 비 침범 성 이미징 modalities의 급속 한 발전 설치류 전 임상 모델 분야의 성장을 육성 시켰다. 크게 여러 시간 시점에 같은 눈에 망막의 형태학 상 변화를 모니터링 하는 기능, 동물 사용의 감소에 기여 하 고 실험 연구에서 효율을 증가. CNV 변의 조직학 평가 오히려 간단 하며 레이저 관리, 이미지 수집 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 지역/볼륨 추정의 사이트 주위 비정상적인 혈관 성장의 라벨. 대조적으로, vivo에서 화상 진 찰 양식 CNV 병리학과 그 해석의 더 복잡 한 분석을 소개합니다.

여기 우리는 간단 하 고 비교적 빠른 방법을 제시 학년 유도, 진행, CNV의 회귀를 FA, SD-10 월를 사용 하 여 및 마우스에 자동된 분할 방법 레이저 유도 CNV 모델.

프로토콜

모든 동물 ARVO 문을 따라 동물에 대 한 사용의 안과 및 비전 연구 및 동물 실험에 대 한 EC 지침 86/609/EEC 승인 및 핀란드의 동물 실험 보드에 의해 모니터링 프로토콜을 사용 하 여 치료를 받았다.

1. 레이저 유도 마우스 CNV 모델 ⁵

1. 거시적 어떤 이상에 대 한 동물의 눈을 검사 합니다.
2. 마우스 무게.
3. 계산 하 고 동물, 예를 들면 medetomidine (1 mg/kg), 케 타 민 (75 mg/kg), 그리고 1:1.5:2.5, 또는 마 취 제 (40-75 mg/kg)의 비율 (0.9 %NaCl 용액) 증류수의 혼합물의 무게에 따라 사용, 마 취약의 적절 한 금액을 준비 xylazine (5 mg/kg), 그리고 1:2.; 5: 1의 비율로 증류수 (0.9 %NaCl 용액) 20 g 마우스에 대 한 혼합물의 0.1 mL를 주사.
4. Intraperitoneally 마 취 제를 주사.
5. 동물 마 취 때까지 감 금 소 및 대기에 다시 마우스를 놓습니다. 마우스는 제대로 페달 반사의 부족에 의해 anesthetized 확인 합니다.
6. 레이저 안전 개인 보호 장비를 사용 하 여를 확인 합니다.
7. 슬릿 램프와 532 nm 다이오드 레이저를 켭니다.
8. 감 금 소 및 난방 패드에 장소에서 마우스를 제거 합니다.
9. 동 공 팽창에 대 한 Tropicamide의 한 방울을 적용 합니다. 전체 (3 mm) 동 공 팽창에 대 한 3-5 분을 기다립니다.
10. 슬릿 램프의 단계에 마우스를 놓습니다.
11. Applanate 각 막에 coverslip에 opthalmic 액체 젤의 한 방울을 배치 합니다.
12. 마우스 눈을 센터에 시 신경 머리의 방향을 정하십시오.
13. 100 레이저 전원 설정 mW, 100 ms, 기간 및 50 μ m 스팟 사이즈.
14. 망막 안료 상피 (RPE)에 레이저 빔을 초점.
15. 각각 4, 8, 및 12 시 시 신경 주위에 위치에 이상적으로 망막 혈관을 피하 여 레이저 촬영 한 눈에 확인 합니다. 모든 레이저 망막 출혈의 부재에 대 한 촬영 후 눈의 저를 검사 합니다. Contralateral 눈 비에서 컨트롤 역할을 합니다.
16. 다시가 열 패드에 coverslip 및 장소 마우스를 삭제 합니다.
17. 두 눈에 한 방울 못 젤 방울을 적용 합니다.

2. SD-10 월 ^6,7

1. 설치류 맞춤 단계에 마우스를 놓고 머리를 고정 합니다.
2. Vivo에서 이미징 X 및 Y 단계 컨트롤러를 사용 하 여 SD 10 월 시스템 (예를 들어, Bioptigen/Leica Envisu R2200) 얼굴 눈의 렌즈를 맞춥니다.
3. Bruch의 막의 휴식을 확인 하기 위해 SD 10 월 검사: 일단 SD-10 월 전체 눈 검사, 수동으로 이동할 참조 라인 lasered 사이트. Bruch의 막의 나누기에서 영역 ( 그림 1참조)에 명확 하 게 볼 수 있어야 합니다.

3. fluorescein 제품은 ^7,,89

1. 홀더, 마우스를 제거 하 고 (예를 들어, 하이델베르크 Spectralis HRA2) FA 시스템에 그것을 배치.
2. 레이저에 초점 적외선 반사율 모드를 사용 하 여 보기 창 중간에 시 신경의 머리와 눈의 저 분야를 구울.
3. 피하 또는 intraperitoneally 5 %fluorescein 나트륨 소금 20 g 마우스에 대 한 0.1 mL를 주사.
4. 안 수준에 초점을.
5. 안 초점 수준에서 이미지를 가져가 라.
6. 다시 망막 수준에 집중 하 고 이미지를 가져가 라.
7. 30 s 및 반복 단계 3.4-3.6 기다립니다.
8. 소유자에서 마우스를 제거 하 고 난방 패드에 그것을 배치.
9. Α2-medetomidine, atipamezole (0.5 mg/kg, i.p.), 또는 마 취에서 동물 복구에 대 한 대기에 대 한 적으로 마 취를 반대로.
10. 반복 에서 vivo SD 10 월 및 FA 이미징 마 취 동물에 후속 일 5, 10, 14에.

4. CNV 등급

1. 학년 10 월 이미지와 다음 날 0 lasering 직후 찍은 안 FA 이미지에서 Bruch의 막의 손상:
   0-Bruch의 멤브레인은 손상 되지
   1-Bruch의 막의 성공적인 손상
2. 학년 누설 fluorescein 신호 다음으로 망막 FA 이미지의 일련에서의 역학을 비교 하 여 관찰 했다에서 관광 명소에서 CNV의 존재:
   0-망막의 정상적인 외관
   누설의 0.5-희미 한 얼룩
   1.0-새 CNV 영역
   참고: 사용 하 여 OCT 영상 CNV의 또는 의심 FA에서 추가 확인 10 월 이미지에 intraretinal 액체의 존재 CNV 등급 좋을 곳.

5. 망막 두께 측정

1. 자동된 분할 소프트웨어를 사용 하 여 망막 두께 측정. RPE (건강 측정 사이트), 또는 RPE 손상 (레이저 사이트)의 사이트에 연결 하는 가상 선 신경 섬유 층에서 모든 층의 간격으로 총 망막 두께 간주 됩니다 확인 하십시오 ( 그림 7참조).

결과

거품 또는 subretinal lasering 직후 출혈은 항상 보이지 않는다입니다. 따라서, SD-10 월은 특히 Bruch의 막의 손상을 확인 하는 것이 중요. 그림 1 레이저 관리 후 다른 시간 지점에서 10 월 이미징의 예를 보여 줍니다.

그림 1

토론

복합 영상 CNV 병리학 평가 위한 귀중 한 도구를 제공합니다. 여기 우리는 FA, 구성 된 이미징 프로토콜 제시 SD-10 월, 그리고 CNV 병 리의 재현, 빠르고 신뢰할 수 있는 평가 대 한 자동 세분화. Bruch의 막 레이저 관리가 확인 후의 휴식. 또한,이 단계에서 SD OCT를 사용 하 여도 해석 결과의 혼동 수 있습니다 가능한 intraretinal 및 subretinal 출혈의 즉각적인 시각화 허용. 망막 누수 FA 이미지에서 fluorescein 신?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine (commercial name Domitor)	Orion	Vnr 01 56 02	Anesthesia
Ketamine	Intervet	Vnr 51 14 85	Anesthesia
0,9% NaCl	B Braun	357 0340	Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet)	Bayer	vnr 14 89 99	Anesthesia
Tropicamide	Santen	Vnr 04 12 36	Mydriatic agent
Viscotears	Alcon	Vnr 44 54 81	Lubricant
Systane	Alcon	-	Lubricant
5% Fluorescein sodium salt	Sigma Aldrich	F6377-100G	Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan)	Orion	Vnr 47 19 53	Anesthesia