In Vivo Imaging multimodale e l'analisi di Mouse indotta da Laser modello di Neovascularization coroidico

Riepilogo

Qui, presentiamo l'utilità di longitudinale in vivo imaging nel follow-up dei cambiamenti morfologici del neovascularization coroidico laser-indotta in topi.

Abstract

Indotta da laser il neovascularization coroidico (CNV) è una modella ben affermata per imitare la forma umida di degenerazione maculare senile (AMD). In questo protocollo, ci proponiamo di guidare il lettore non semplicemente attraverso le considerazioni tecniche di generare lesioni indotte da laser per innescare processi neovascolare, ma piuttosto concentrarsi sulle informazioni potenti che possono essere ottenute da multimodal longitudinale in vivo imaging durante tutto il periodo di follow-up.

Il topo indotta da laser modello CNV è stato generato da un'amministrazione di laser del diodo. Tecniche di imaging multimodale in vivo sono stati utilizzati per monitorare la CNV induzione, progressione e regressione. Primo, tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) è stata effettuata immediatamente dopo la lavorazione laser per verificare una rottura della membrana di Bruch. Successivi in vivo imaging mediante angiografia della fluorescina (FA) ha confermato il successo danno della membrana di Bruch da seriale immagini acquisite a livello della coroide. Follow-up longitudinale di proliferazione di CNV e regressione nei giorni 5, 10 e 14 dopo la lavorazione laser è stato effettuato usando sia SD-OCT e FA. Semplice e affidabile di classificazione di leasions di CNV che perde da FA immagini è presentato. Segmentazione automatizzata per la misurazione dello spessore retinico totale, combinato con applicazione manuale calibro per la misurazione dello spessore retinico a siti CNV, consentire la valutazione imparziale della presenza dell'edema. Infine, verifica istologica di CNV viene eseguita utilizzando isolectin GS-IB4 colorazione sul flatmounts coroidico. La colorazione è con soglia, e viene calcolata l'area isolectin-positivi con ImageJ.

Questo protocollo è particolarmente utile negli studi di terapeutica che richiedono alta-velocità di trasmissione-come proiezione di patologia CNV quanto consente veloce, multimodale e affidabile classificazione dell'edema di patologia e retinico CNV. Inoltre, ad alta risoluzione SD-OCT consente la registrazione di altre caratteristiche patologiche, come l'accumulazione di liquido subretinal o intraretinico. Tuttavia, questo metodo non fornisce la possibilità di automatizzare l'analisi di volume CNV da immagini SD-OCT, che deve essere eseguita manualmente.

Introduzione

Il primo tentativo riuscito di imitare la patologia di CNV umana nei roditori è stato dimostrato quasi tre decenni fa con un laser di krypton a lungo Evans ratti¹. Da allora in poi, un laser di krypton è stato utilizzato per rompere la membrana di Bruch nel ceppo più popolare del mouse C57BL/6J^2,3,4. Il tasso di successo dell'induzione di CNV è stato verificato con FA e macchie istologiche. Un rapido sviluppo di modalità di imaging non invasivo, ad esempio OCT, ha favorito la crescita del campo di modelli preclinici del roditore. La possibilità di monitorare i cambiamenti morfologici nella retina a più punti di tempo nello stesso occhio significativamente contribuisce alla riduzione dell'uso di animali e aumenta l'efficienza negli studi sperimentali. La valutazione istologica delle lesioni CNV è piuttosto semplice e richiede etichettatura di crescita vascolare anormale intorno al sito di amministrazione di laser, acquisizione di immagini e stima di superficie/volume utilizzando un software di analisi di immagine. Al contrario, la modalità di imaging in vivo introdurre più complesse analisi di CNV patologia e sua interpretazione.

Qui presentiamo un metodo semplice e relativamente veloce per induzione di grado, la progressione e regressione di CNV utilizzando FA, SD-OCT, e il metodo di segmentazione automatizzata nel topo indotta da laser CNV modello.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati in conformità con la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e CE direttiva 86/609/CEE per gli esperimenti sugli animali, utilizzando protocolli approvati e monitorati dal Consiglio esperimento animale della Finlandia.

1. indotto da laser mouse CNV modello ⁵

1. Ispezionare gli occhi dell'animale in modo macroscopico per eventuali anomalie.
2. Pesare il mouse.
3. Calcolare e preparare un'appropriata quantità di anestetici da utilizzare, in base al peso dell'animale, ad esempio una miscela di medetomidina (1 mg/kg), ketamina (75 mg/kg) e acqua distillata (soluzione di NaCl 0,9%) a un rapporto di 1:1.5:2.5, o ketamina (40-75 mg/kg), xilazina (5 mg/kg) e acqua distillata (soluzione di NaCl 0,9%) a un rapporto di 1:2. 5:1; per un mouse 20g, iniettare 0,1 mL della miscela.
4. Iniettare anestetico per via intraperitoneale.
5. Posizionare il mouse nuovamente dentro la gabbia e aspettare fino a quando l'animale è anestetizzato. Confermare che il mouse è adeguatamente anestetizzato dalla mancanza di una reflex pedale.
6. Garantire l'uso di dispositivi di protezione individuale sicurezza laser.
7. Accendere una lampada a fessura e un laser a diodo 532 nm.
8. Rimuovere il mouse dalla gabbia e posto il termoforo.
9. Applicare una goccia di Tropicamide per dilatazione pupillare. Attendere 3-5 min per la dilatazione pupillary pieno (3 mm).
10. Posizionare il mouse sul palco della lampada a fessura.
11. Depositare una goccia di gel liquido opthalmic su un vetrino coprioggetto per applanate la cornea.
12. Orientare l'occhio del mouse con la testa del nervo ottico nel centro.
13. Impostare la potenza del laser a 100 mW, la durata di 100 ms e la dimensione dello spot a 50 µm.
14. Focalizzare il fascio laser sull'epitelio pigmentato retinico (RPE).
15. Fare tre colpi di laser in un occhio evitando vasi sanguigni retinici idealmente a 4, 8 e 12 posizioni intorno al nervo ottico, rispettivamente. Ispezionare il fondo dell'occhio dopo tutti i laser scatti per assenza di emorragia retinica. L'occhio controlaterale serve come controllo non laserato.
16. Scartare il mouse vetrino coprioggetti e posto indietro il termoforo.
17. Applicare una goccia di PEG gel gocce su entrambi gli occhi.

2. SD-OCT ^6,7

1. Posizionare il mouse in fase di allineamento del roditore e immobilizzare la testa.
2. Allineare la lente del sistema SD-OCT (ad es., Bioptigen/Leica Envisu R2200) ad affrontare l'occhio per l'imaging in vivo utilizzando controller X - e Y-stage.
3. Eseguire scansioni di SD-OCT per verificare rotture della membrana di Bruch: una volta che il SD-OCT scansiona l'intero occhio, spostare manualmente la linea di riferimento sui siti laserati. Rotture della membrana di Bruch devono essere chiaramente visibile nelle aree laserate (Vedi Figura 1).

3. fluoresceina angiografia ^7,8,9

1. Rimuovere il mouse con il titolare e posizionarlo sul sistema FA (ad es., Heidelberg Spectralis HRA2).
2. Messa a fuoco laser masterizzare aree del fondo dell'occhio utilizzando la modalità a raggi infrarossi riflettanza con la testa del nervo ottico al centro della finestra di visualizzazione.
3. Iniettare 0,1 mL di sale di sodio di 5% della fluorescina per un mouse di 20 g per via sottocutanea o per via intraperitoneale.
4. Concentrarsi sul livello della coroide.
5. Prendere un'immagine dal livello di messa a fuoco della coroide.
6. Rimettere a fuoco a livello della retina e prendere un'immagine.
7. Attendere per 30 s e ripetere passaggi 3.4-3.6.
8. Rimuovere il mouse dal supporto e posizionarlo sul rilievo di riscaldamento.
9. Invertire l'anestesia α2-antagonista per medetomidina, atipamezolo (0,5 mg/kg, i.p.) o attesa per animale recupero dall'anestesia.
10. Ripetere in vivo SD-OCT e FA imaging in animali anestetizzati sui giorni di follow-up 5, 10 e 14.

4. CNV classificazione

1. Grado il danno della membrana di Bruch da immagini di ottobre e coroidica FA immagini scattate subito dopo la lavorazione al laser il giorno 0 come segue:
   0 - membrana di Bruch non è stata danneggiata
   1 - successo danno della membrana di Bruch
2. Grado la presenza di CNV da laserata macchie che aveva perdite come osservato confrontando la dinamica del segnale della fluorescina in una serie di immagini retiniche FA come segue:
   0 - aspetto normale della retina
   0,5 - macchiatura debole di perdita
   1.0 - aree CNV che perde
   Nota: Utilizzare l'imaging OCT per ulteriore conferma di CNV o in discutibile FA dove la presenza di liquido intraretinico in immagini di ottobre vorrei suggerire CNV classificazione.

5. misure di spessore retinico

1. Utilizzare un software di segmentazione automatizzata per le misurazioni dello spessore retinico. Assicurarsi che lo spessore totale della retina è considerato, come lo spessore degli strati tutti da strato delle fibre nervose di RPE (siti di misura sano) o di una linea immaginaria che collega RPE intorno al sito di danno (laserate siti) (Vedi anche Figura 7).

Risultati

Una bolla o subretinal sanguinamento immediatamente dopo lavorazione laser non è sempre visibile. Pertanto, SD-OCT è particolarmente importante per verificare il danno della membrana di Bruch. Figura 1 Mostra un esempio di formazione immagine OCT a tempi diversi dopo la somministrazione di laser.

Discussione

Imaging multimodale offre preziosi strumenti per la valutazione di patologia CNV. Qui abbiamo presentato un protocollo imaging composto da FA, SD-OCT e segmentazione automatica per la valutazione rapida, riproducibile e affidabile di patologia CNV. Una rottura della membrana di Bruch dopo amministrazione del laser è stato confermato. Inoltre, l'uso di SD-OCT in questa fase anche ha permesso la visualizzazione immediata delle possibili emorragie intraretiniche e subretinal, che può confondere l'interpretazione dei risul...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine (commercial name Domitor)	Orion	Vnr 01 56 02	Anesthesia
Ketamine	Intervet	Vnr 51 14 85	Anesthesia
0,9% NaCl	B Braun	357 0340	Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet)	Bayer	vnr 14 89 99	Anesthesia
Tropicamide	Santen	Vnr 04 12 36	Mydriatic agent
Viscotears	Alcon	Vnr 44 54 81	Lubricant
Systane	Alcon	-	Lubricant
5% Fluorescein sodium salt	Sigma Aldrich	F6377-100G	Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan)	Orion	Vnr 47 19 53	Anesthesia