אין ויוו הדמיה עם מודאלים מרובים וניתוח של עכבר לייזר המושרה חיבור כורוידאלית דגם

Summary

כאן, אנו מציגים את התועלת של האורך ויוו הדמיה מעקב אחר שינויים מורפולוגיים של לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית בעכברים.

Abstract

לייזר המושרה neovascularization כורוידאלית (CNV) היא דוגמנית ומבוססת לחקות את צורת רטוב הקשורות לגיל ניוון מקולרי (AMD). ב פרוטוקול זה, אנו שואפים מדריך את הקורא לא פשוט על-ידי השיקולים הטכניים של יצירת נגעים לייזר המושרה להנעת תהליכים neovascular, אבל מעדיף להתמקד במידע רב עוצמה ניתן להשיג יחידנית או משולבת האורך אין ויוו הדמיה לאורך כל תקופת המעקב.

עכבר לייזר המושרה CNV המודל נוצר על ידי המינהל לייזר דיודה. עם מודאלים מרובים ויוו טכניקות הדמיה שימשו כדי לפקח CNV אינדוקציה, התקדמות, רגרסיה. ראשית, תחום ספקטרלי טומוגרפיה אופטית קוהרנטית (SD-אוקטובר) בוצע מיד לאחר lasering כדי לוודא הפסקה של הממברנה של ברוך. לאחר מכן ויוו הדמיה באמצעות fluorescein מסתמים (FA) אישר נזק מוצלחת של הממברנה של ברוך מתמונות טורי רכשה באותה רמת חיבור. מעקב האורך של התפשטות CNV ו רגרסיה בימים 5, 10 ו- 14 לאחר lasering בוצעה באמצעות הפא ו- SD-אוקטובר. פשוטה ואמינה לדירוג של דולף leasions CNV מתמונות פא מוצג. פילוח אוטומטיים למדידת עובי הרשתית הכולל, בשילוב עם קליבר ידנית יישום למדידת עובי הרשתית באתרים CNV, לאפשר הערכה לא משוחדת של הנוכחות של בצקת. לבסוף, אימות היסטולוגית של CNV מתבצעת באמצעות isolectin GS-IB4 מכתים על flatmounts חיבור. ההכתמה היא thresholded, אזור isolectin-חיוביות מחושבת עם ImageJ.

פרוטוקול זה שימושי במיוחד לימודי הרפוי הדורשים דמויי תפוקה גבוהה הקרנת CNV פתולוגיה, שכן היא מאפשרת מהר, עם מודאלים מרובים, סיווג אמין של בצקת רשתית לפתולוגיה CNV. בנוסף, רזולוציה גבוהה SD-OCT מאפשר ההקלטה של המחפשים פתולוגיים אחרים, כגון הצטברות נוזלים subretinal או intraretinal. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת אפשרות להפיכת ניתוח אמצעי האחסון CNV מתמונות SD-אוקטובר, אשר חייב להתבצע באופן ידני.

Introduction

הניסיון המוצלח הראשון לחקות הפתולוגיה של האדם CNV בחולדות הודגם לפני כמעט שלושה עשורים עם לייזר קריפטון לונג-אוונס חולדות¹. לאחר מכן, שימש לייזר קריפטון לפרוץ קרום של ברוך המתח העכבר הפופולרי ביותר,^3,2,C57BL/6J⁴. שיעור ההצלחה של אינדוקציה CNV אומתה עם הפא וכתמים היסטולוגית. התפתחות מהירה של שיטות הדמיה לא פולשנית, כגון OCT, תמכה את הצמיחה של השדה של מכרסמים במודלים פרה. היכולת לעקוב אחרי שינויים מורפולוגיים הרשתית בנקודות זמן מרובים בעיניים אותו משמעותית תורם צמצום הניצול של בעלי החיים ומגביר את יעילות במחקרים ניסיוני. הערכה היסטולוגית של נגעים CNV הוא די פשוט, ודורש תיוג צמיחת כלי דם נורמלי סביב האתר של המינהל לייזר, ייבוא תמונות/שטח בנפח הערכה באמצעות תוכנת ניתוח של התמונה. לעומת זאת, אין ויוו שיטות הדמיה להציג ניתוחים מורכבים יותר של פתולוגיה CNV והפרשנות שלה.

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה יחסית כיתה אינדוקציה, התקדמות של רגרסיה של CNV באמצעות הפא, SD-אוקטובר, ואת שיטת פילוח אוטומטית העכבר לייזר המושרה CNV מודל.

Protocol

כל החיות טופלו לפי המשפט ארוו עבור שימוש של חיות לרפואת עיניים, ומחקר החזון של EC Directive 86/609/EEC לניסויים בבעלי חיים, באמצעות פרוטוקולים אישרה, בפיקוח של חיות ניסוי לוח של פינלנד.

1. לייזר המושרה העכבר CNV דגם ⁵

1. לבדוק את העיניים של החיה בעין בלתי מזוינת על חריגות.
2. שוקלים את העכבר.
3. לחשב ולהכין כמות מספקת של חומרי הרדמה לשימוש, בהתבסס על המשקל של החיה, למשל תערובת של medetomidine (1 מ"ג/ק"ג), קטמין (75 מ"ג/ק"ג), מים מזוקקים (0.9% NaCl פתרון) ביחס של 1:1.5:2.5, או קטמין (40-75 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג), מים מזוקקים (0.9% NaCl פתרון) ביחס של 1:2. 5:1; עכבר 20 גרם, מזריקים 0.1 מ"ל של תערובת.
4. להזריק הרדמה intraperitoneally.
5. הנח את העכבר בחזרה לתוך הכלוב. חכה עד חיה. הוא מורדם. לאשר שהעכבר הוא מורדם כראוי על ידי חוסר רפלקס פדלים.
6. להבטיח את השימוש בלייזר בטיחות ציוד מגן אישי.
7. הפעל מנורה שסע ואת 532 ננומטר דיודת לייזר.
8. הסר את העכבר הכלוב ואת המקום על כרית חימום.
9. החל טיפה אחת של Tropicamide עבור התרחבות האישון. המתן 3-5 דקות על התרחבות האישון מלא (3 מ"מ).
10. הנח את העכבר על הבמה מנורת סדק.
11. במקום טיפה אחת של ג'ל נוזלי עיניים על coverslip כדי applanate הקרנית.
12. אוריינט את העין העכבר עם ראש עצב הראייה במרכז.
13. להגדיר את עוצמת הלייזר עד 100 מגה-וואט, המשך ל-100 מילישניות, והגודל ספוט 50 מיקרומטר.
14. מתמקדים קרן הלייזר אפיתל הפיגמנט ברשתית (RPE).
15. עושים שלוש יריות לייזר לתוך עין אחת על ידי הימנעות כלי הדם ברשתית ממוקם באופן אידיאלי ב- 4, 8 ו 12 o ' שעון עמדות סביב עצב הראייה, בהתאמה. בדוק את הפונדוס של העין לאחר כל לייזר יריות להיעדרות מדימום ברשתית. העין contralateral משמש פקד ללא lasered.
16. למחוק את העכבר coverslip ומקום חזרה על כרית החימום.
17. החל טיפה אחת של פג ג'ל טיפות על שתי העיניים.

2. SD-אוקטובר ^6,7

1. למקם את העכבר הבמה יישור מכרסמים, לשתק את הראש.
2. יישר את העדשה של מערכת SD-אוקטובר (למשל, Envisu R2200 Bioptigen/Leica) להתמודד עם העין עבור ויוו הדמיה באמצעות בקרי X ו- Y-שלב.
3. לבצע סריקות SD-OCT כדי לוודא הפסקות של הממברנה של ברוך: לאחר ה-SD-OCT סריקות לעין כל, להעביר באופן ידני את קו הפניה באתרים lasered. הפסקות של הממברנה של ברוך צריך להיות בבירור באזורים lasered (ראה איור 1).

3. fluorescein מסתמים ^7,8,9

1. להסיר את העכבר עם בעל, ומניחים אותו על מערכת ה-FA (למשל, היידלברג Spectralis HRA2).
2. ההתמקדות ב לייזר לצרוב תחומי הפונדוס של העין באמצעות מצב השתקפות אינפרא-אדום עם ראש עצב הראייה באמצע החלון הצפייה.
3. מזריקים 0.1 מ"ל של 5% fluorescein מלח נתרן עכבר 20 גרם subcutaneously או intraperitoneally.
4. מתמקדים רמת חיבור.
5. קחו תמונה רמת המיקוד חיבור.
6. מחדש להתמקד ברמת הרשתית, לקחת תמונה.
7. המתן 30 s וחזור על צעדים 3.4-3.6.
8. להסיר את העכבר ממחזיק והנח אותו על משטח חימום.
9. הפוך הרדמה על ידי α2-אנטגוניסט עבור medetomidine, atipamezole (0.5 מ"ג/ק"ג, i.p.) או לחכות בעלי חיים ההתאוששות מן ההרדמה.
10. חזור ב vivo SD-אוקטובר ו- FA הדמיה בבעלי חיים ומורדמת בימים מעקב 5, 10 ו- 14.

4. CNV לדירוג

1. כיתה הנזק של הממברנה של ברוך OCT תמונות ותמונות פא חיבור נלקח מיד לאחר lasering ביום 0 כדלקמן:
   0 - הממברנה של ברוך לא נפגע
   1 - נזק מוצלח של הממברנה של ברוך
2. ציון הנוכחות של CNV מאתרי lasered שהיה זליגת כפי שנצפה על ידי השוואת הדינמיקה של האות fluorescein בסדרה של תמונות פא ברשתית להלן:
   0 - מראה נורמלי של הרשתית
   0.5 - להתעלף מכתים של דליפה
   1.0 - אזורים CNV דולפים
   הערה: השתמש ההדמיה OCT לאישור נוסף של CNV או בספק פא היכן הנוכחות של נוזל intraretinal בתמונות OCT מציע CNV לדירוג.

5. מדידות עובי הרשתית

1. השתמש תוכנה פילוח אוטומטיות עבור מדידות עובי הרשתית. להבטיח כי נחשב את עובי הרשתית הכולל, כמו העובי של כל השכבות משכבת סיבי עצב RPE (מידה בריאה אתרים), או קו דמיוני המחבר RPE סביב האתר של נזק (אתרים lasered) (ראה גם איור 7).

תוצאות

בועה או subretinal דימום מיד לאחר lasering אינו תמיד גלוי. לכן, SD-אוקטובר חשוב במיוחד לוודא נזק של הממברנה של ברוך. איור 1 מראה דוגמה של OCT הדמיה בנקודות זמן שונות לאחר לייזר המינהל.

Discussion

הדמיה עם מודאלים מרובים מציע כלי רב ערך עבור הערכה פתולוגיה CNV. כאן הצגנו פרוטוקול הדמיה המורכב של הפא, SD-אוקטובר, פילוח אוטומטית על הערכה מהירה, לשחזור ואמין של הפתולוגיה CNV. הפסקה של הממברנה של ברוך לאחר לייזר הניהול אושר. בנוסף, השימוש SD-אוקטובר בשלב זה מותר גם מיידית החזיית אפשרי שטפי intrare...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine (commercial name Domitor)	Orion	Vnr 01 56 02	Anesthesia
Ketamine	Intervet	Vnr 51 14 85	Anesthesia
0,9% NaCl	B Braun	357 0340	Anesthesia
Xylazine (commercial name Rompun vet)	Bayer	vnr 14 89 99	Anesthesia
Tropicamide	Santen	Vnr 04 12 36	Mydriatic agent
Viscotears	Alcon	Vnr 44 54 81	Lubricant
Systane	Alcon	-	Lubricant
5% Fluorescein sodium salt	Sigma Aldrich	F6377-100G	Fluoresent agent
Atipamezole (commercial name Antisedan)	Orion	Vnr 47 19 53	Anesthesia