باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

Summary

الهجرة الخلية أمر ضروري لتطوير وصيانة الأنسجة وإصلاح، توموريجينيسيس، ويخضع لعوامل النمو والمستقطبات السيتوكينات. ويصف هذا البروتوكول المقايسة دوت، مقايسة هجرة ثنائية الأبعاد، وغير المقيد لتقييم النمط الظاهري المهاجرة من أوراق خلية المرفقة، متماسك استجابة لمنبهات ميكرونفيرونمينتال.

Abstract

على الرغم من أن الكائنات الحية معقدة تبدو ثابتة، أنسجتها تحت دوران مستمر. كما خلايا العمر، يموت، وهي الاستعاضة عن خلايا جديدة، الخلايا تتحرك داخل الأنسجة بطريقة مدبرة محكم. أثناء تطوير الورم، تشعر بالانزعاج هذا التوازن، وترك ورم خلايا ظهارة المنشأ لغزو المكروية المحلية، بالسفر إلى مواقع بعيدة، وتشكل في نهاية المطاف الأورام المنتشر في مواقع بعيدة. المقايسة دوت مقايسة هجرة غير مقيدة بسيطة، ثنائي الأبعاد، لتقييم صافي حركة أوراق الخلية إلى منطقة خالية من الخلية، وتحليل معلمات الهجرة الخلية باستخدام التصوير بمرور الزمن. وهنا يتضح المقايسة دوت استخدام الإنسان الغازية، ومستعمرة الرئة تشكيل خط خلية سرطان الثدي، MCF10CA1a، لتحليل استجابة للخلايا المهاجرة لعامل نمو البشرة (لو)، الذي يعرف بزيادة إمكانات خبيث لخلايا سرطان الثدي و لتغيير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا.

Introduction

فحوصات الهجرة تستخدم على نطاق واسع لتقييم الإمكانات الغازية والمنتشر لورم الخلايا في المختبر. الأكثر شيوعاً، يستخدم بالجرح أو المقايسة الصفر لتقييم هجرة أوراق الظهارية في خلية بمسح منطقة^1،2،3. لإجراء فحص الصفر، يتم مطلي الخلايا إلى أحادي الطبقة و "الصفر" أو منطقة خالية من خلية تم إنشاؤه باستخدام تلميح ماصة. مقايسة الصفر من السهل إعداد مع الإمدادات المتاحة عادة زراعة الأنسجة، ويمكن أن يؤديها في لوحات متعددة جيدا، مما يسمح لتجهيز عينات متعددة. ومع ذلك، كما هو الصفر، الخلايا يتم إزالتها فعلياً من أحادي الطبقة وغالباً الخضوع لموت الخلايا. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تلف المصفوفة خارج الخلية التي تعلق على اللوحة خلال عملية الخدش. وبالمثل، إدراج استخدام السليكون (مثل الدوائر عبدي⁴) أو من الاستنسل^5،،من⁶⁷ يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الميكانيكي للخلايا وإزالة جزئية من البروتينات المصفوفة تستخدم لطلاء لوحات. وثمة عيب آخر من فحوصات رصد إقفال الجروح أو الخدوش هو دورتهم الوقت المحدود، كما يمكن فقط تحليل الهجرة الخلية حتى يتم إغلاق الصفر.

في إجراء المقايسة دوت، هي مطلي الخلايا كمستعمرة تعميم على لوحة مغلفة أو غير المصقول⁸. والأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية والطلاء هو الحصول على أوراق الخلية مع حواف محددة، يمكن ترحيل أو غزو في المناطق المحيطة بها خالية من الخلية دون الإخلال الثقافة بإزالة خلايا أو إدراج. والهدف العام للمقايسة دوت مراقبة الهجرة صحائف خلية مقاسا بحافة التشرد أو القطر مستعمرة، فضلا عن القيام بتصوير مرور الزمن لتحليل النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا في أعلى القرار الزمانية.

يمكن أن تتأثر الهجرة الخلية بالعديد من الإشارات ميكرونفيرونمينتال مثل المستقطبات، السيتوكينات، وعوامل النمو مثل مماثلة. لو هو عامل النمو التي تمارس إثارة البيولوجية عن طريق ربط لمستقبلات لها، لو مستقبلات⁹، ويزيد من السلوك الغازية والمنتشر من ورم الخلايا^4،،من⁹¹⁰. هنا، يتم استخدام المقايسة دوت لدراسة مماثلة وحفز الهجرة الخلية في مستعمرة الرئة بشرية الغازية، تشكيل الثدي سرطان الخلية خط (MCF10CA1a)^8،،من¹¹¹².

Protocol

1-طلاء أطباق (1 يوم)

ملاحظة: تأكد من عدم ترك بصمات الأصابع أو الاوساخ على الجزء السفلي من اللوحة عند التعامل مع الأمر.

1. ذوبان الجليد الماوس الكولاجين الرابع على الجليد، وتمييع مع 50 ملم HCl (pH 1.3) لإعداد 3 مل من 10 ميكروغرام/مل الكولاجين الحل الرابع.
   ملاحظة: سوف يعجل بالكولاجين عند 37 درجة مئوية. ولذلك من المهم أن تبقى الحل الكولاجين عند درجة حرارة منخفضة بينما ذوبان الجليد والعمل معها. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة بإعداد مختبرين حجم مناسب وتخزينها في-80 درجة مئوية.
2. إضافة 250 ميليلتر الكولاجين الرابع الحل لكل بئر من لوحات أسفل الزجاج 12-جيدا ووضعها في علبة بلاستيكية حجم مناسب، ومحكم الإغلاق. ضع منشفة ورقية رطبة أكثر وحول لوحات لتصنيع دائرة رطبة وإغلاق المربع. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: فقط منطقة النمو يجب أن تكون مغلفة, أنها كافية لتغطي فقط بكشف الغطاء، الذي هو تعلق على الجزء السفلي من اللوحة، مع حل الكولاجين (انظر الشكل 1أ وب لتخطيطي للوحة).
3. صباح اليوم التالي، شطف اللوحات مع منزوع ح₂س مرتين لإزالة عدم استيعاب الكولاجين والمخزن المؤقت. توجيه الماء إلى حافة اللوحة جيدا، لا إلى الحافة التي شكلتها أسفل اللوحة وساترة (إذا كان هو بيبيتيد المياه في هذا المجال سوف دفقة). أيردري اللوحات في هود الاندفاق الصفحي. استخدام لوحات فورا أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام.
   ملاحظة: قد تتطلب خطوط الخلايا مختلفة مختلفة طلاء، مثل فيبرونيكتين أو الكولاجين أنا.

2-طلاء المقايسة دوت (اليوم 2)

1. إعداد تعليق خلية
   1. لإعداد تعليق خلية، استخدم الخلايا التي قد نمت في طبق استنبات الأنسجة 60 ملم في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 5% إلى 80% التقاء
   2. شطف الخلايا مع دولبيكو خالية من الكالسيوم والمغنيزيوم الفوسفات مخزنة المالحة (دببس) مرة واحدة وإضافة 500 ميليلتر التربسين-يدتا (درجة حرارة الغرفة)، واحتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO₂، جو هوميديفيد.
   3. تعليق الخلايا المنفصلة في 4.5 مل الثقافة المتوسطة لوقف نشاط التربسين والتعويل 20 قاسمة ميليلتر من تعليق خلية في هيموسيتوميتير.
   4. بيليه الخلايا المتبقية في أنبوب مخروطي 15 مل بالطرد المركزي في 200 غ س لمدة 3 دقائق ونضح المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في المتوسط 3 × 10⁶ خلايا/مل والثقافة.
      ملاحظة: لطلاء ركائز أخرى و/أو خطوط الخلايا، يجب إنشاء كثافة الخلية المثلى في سلسلة تمييع. ويوصي 3 × 10⁶ خلية/مل كنقطة انطلاق.
2. طلاء الخلايا
   1. مكان قطره 10 ميليلتر من تعليق خلية في مركز كل كشف الغطاء الكولاجين الرابع مغلفة بالزجاج 12-جيدا أسفل لوحة دون لمس أو خدش الطلاء (الشكل 1أ، ب). احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، جو هوميديفيد، للسماح للخلايا إرفاق. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا موصولة.
      ملاحظة: هذا يمكن أفضل رؤية عند الحافة من الانخفاض، حيث يمكن ملاحظة تشكيل أحادي الطبقة (الشكل 1ج). إذا لزم الأمر، احتضان اللوحة يصل إلى حاء 3 يجب التأكد من أن نسبة الرطوبة في الحاضنة عالية بما يكفي كما القطرات يمكن أن تجف بسرعة. إذا لوحظ انخفاضا في حجم قطره أثناء هذه الخطوة، إضافة برنامج تلفزيوني للمسافات بين الآبار زيادة الرطوبة.
   2. غسل الآبار مع 1 مل من الثقافة المتوسطة مرتين لإزالة الخلايا غير مرفقة بلطف. أضف 1 مل الثقافة المتوسطة لكل بئر. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا العائمة لا تبقى، إلا تغسل الآبار مرة أخرى. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂، جو هوميديفيد، للحصول على أوراق خلية محددة تحديداً جيدا.
      ملاحظة: من المحتمل إعادة إرفاق إلى اللوحة وتشكل مستعمرات الخلايا غير المرغوب فيها الخلايا العائمة.

3-تحفيز الخلايا (اليوم الثالث)

1. التحقق من جميع الآبار باستخدام مجهر معكوس للتأكد من أن الخلية المستعمرات قد نمت بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، وضع علامة على الآبار غير مناسب ولا يستخدمونها.
2. قم بتسمية كل من لوحة على نحو ملائم لكل شرط التحقيق جيدا. قم بتشغيل كل شرط في تكرار أو ثلاث نسخ.
3. تغيير على المديين المتوسط وتجويع الخلايا في DMEM/F12 المحتوية على مصل الحصان 0.1% (متوسط يتضورون جوعاً) ح 3 قبل أن يتم تحفيز الخلايا.
4. حفز الخلايا بالإضافة لمماثلة (تركيز النهائي 5 نانوغرام/مل) أو الوسطاء الآخرين المطلوب وتخلط بلطف المتوسطة استخدام ميكروبيبيتور 1 مل أو بواسطة يحوم اللوحة.
5. احتضان بلايت 1-4 أيام لمراقبة حافة التشرد وكفاف الحافة كما هو موضح في القسم 4.1 أو إجراء تصوير مرور الزمن كما هو موضح في الجزء 4-2.

4-التصور مستعمرات الخلايا والهجرة الخلية

1. الهيماتوكسيلين-ويوزين (أنه) تلطيخ لقياس نمو مستعمرة (يوم 4-7)
   1. إصلاح الخلايا في الإيثانول 70% (1 مل/جيد) ~ 2 دقيقة.
   2. وصمة عار الأنوية مع الهيماتوكسيلين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
   3. خلايا أغسل بماء الصنبور (1 مل/جيد) حتى الأنوية الأزرق، 5-10 دقيقة.
   4. السيتوبلازم وصمة عار مع ويوزين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
   5. شطف بالمياه (1 مل/جيد).
      ملاحظة: يمكن جمع حلول الهيماتوكسيلين ويوزين واستخدامه عدة مرات إلى تلطيخ تصبح باهتة.
   6. لوحة أيردري.
   7. الوجه اللوحة وقياس قطر دوت مع مسطرة. وبدلاً من ذلك، التقاط صور اللوحة مع كاميرا، وتحليل قطر دوت في إيماجيج.
2. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (3 اليوم)
   1. التبديل في المجهر حاضنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ملء المرطب مع dH₂ضبط O. CO₂ إلى 5%. تأكد من أن الدائرة الحاضنة هو هوميديفيد وأن المرحلة الآلية التي يمكن أن تتحرك بحرية. إغلاق الدائرة الحاضنة والسماح بالمجهر لضبط إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام المجهر (انظر الجدول للمواد) هنا يجب تسخينها إلى 37 درجة مئوية على الأقل 3 ح قبل الخلايا يتم تصويرها لتجنب الانجراف من التركيز.
   2. ضع اللوحة في مرحلة المجهر حاضنة وقم بإعداد قائمة بالمرحلة. حواف الصورة المتعارضة اثنين ومركز كل خلية نقطة (الشكل 1أ).
   3. التقاط صور كل 3 دقائق، ح 15-24 باستخدام هدف X 10. تنزيل البيانات والمضي قدما في تحليل الصورة في برنامج للاختيار، مثلاً، إيماجيج أو مطلب.

النتائج

تم إجراء المقايسة دوت المعروضة هنا (الشكل 1) باستخدام الغازية، مستعمرة الرئة تشكيل خلايا سرطان الثدي (MCF10CA1a) كنظام نموذجي. المقايسة دوت غلة النقاط خلية استنساخه بشدة حتى في اليد للمبتدئين، يجعلها مريحة وسهلة لتنفيذ المقايسة (الشكل 1د

Discussion

أثناء تطور الخلايا السرطانية يهاجر بعيداً عن الأنسجة الأصلية غزو الأنسجة المحيطة والسرطاني إلى مواقع بعيدة¹⁵. ويمكن ملاحظة هجرة خلايا بعيداً عن مستعمرة خلية في المقايسة دوت. ويتجلى المقايسة دوت هنا، تحليل النمط الظاهري المهاجرة من خلايا سرطان الثدي البشرية استجابة لمماثلة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)