Geçiş hücre yaprak analiz etmek için nokta tahlil kullanarak

Özet

Hücre göç geliştirme, doku bakım ve onarım ve tumorigenesis için çok önemlidir ve büyüme faktörleri, kemokinler ve sitokinler tarafından düzenlenmiştir. Bu iletişim kuralı nokta yöntemi, ekli, uyumlu cep yaprak yanıt microenvironmental ipuçlarını göçmen fenotip değerlendirmek için bir iki boyutlu, serbest geçiş tahlil açıklar.

Özet

Karmaşık organizmalara statik görünse de, onların dokular altında sürekli cirosu vardır. Yaş hücreleri ölür ve vardır yeni hücreleri tarafından yerine hücreleri doku içinde sıkıca orkestra bir şekilde hareket. Tümör gelişimi sırasında bu denge bozulmuştur ve tümör hücreleri epitel yerel microenvironment, uzak siteler için seyahat etmek ve sonuçta uzak sitelerdeki metastatik tümörler oluşturmak için istila kökenli bırakın. Nokta tahlil bir boş hücre alana hücre yaprak hareket net değerlendirmek ve parametreleri hızlandırılmış Imaging'i kullanma hücre göç çözümlemek için bir basit, iki boyutlu Kısıtlamasız geçiş tahlil olduğunu. Burada, nokta tahlil epidermal büyüme Malign meme kanseri hücrelerinin potansiyelini artırmak için bilinen faktörü (EGF), hücre göç yanıt çözümlenecek bir insan invaziv, meme kanseri hücre kültürünü, MCF10CA1a, şekillendirme akciğer koloni kullanarak gösterilmiştir ve hücre göç fenotip değiştirmek için.

Giriş

Geçiş deneyleri yaygın olarak tümör hücreleri vitroinvaziv ve metastatik potansiyeli değerlendirmek için kullanılır. En sık, yara veya karalama tahlil epitel sayfaları geçiş bir hücre seçili alan^1,2,3içine değerlendirmek için kullanılır. Kazı-kazan tahlil gerçekleştirmek için hücre monolayer kaplama ve bir "scratch" veya boş hücre alan bir pipet ucu ile oluşturulur. Kazı-kazan tahlil yaygın olarak bulunan doku kültürü malzemeleri ile kurmak kolaydır ve çok iyi Kaplamalar, birden fazla örnekleri işleme için izin, gerçekleştirilebilir. Ancak, sıfırdan yapılmış gibi hücreleri monolayer fiziksel olarak kaldırılır ve sık sık hücre ölümü tabi. Ayrıca, hücre dışı matriks plakasına bağlı kez tırmalamak işlemi sırasında hasar görmüş. Benzer şekilde, silikon kullanımı ekler (Ibidi odaları⁴gibi) veya şablonlar^5,6,7 hücrelerin mekanik bozulma ve kaplama için kullanılan matris proteinlerin kısmi kaldırma yol açabilir tabaklar. Yara ya da çizik kapatılması izleme deneyleri bir diğer dezavantajı kendi sınırlı bir süre ders gibidir çizik kapatılana kadar hücre göç sadece analiz edilebilir.

Nokta tahlil gerçekleştirmek için hücreleri üzerine kaplamalı veya kaplamasız levha⁸dairesel bir koloni olarak kaplama. Bu kaplama strateji için gerekçe göç veya boş hücre çevresinde kültür hücreleri veya ekler kaldırılmasını tarafından rahatsız etmeden istila tanımlı kenarları hücre yaprak elde etmektir. Nokta tahlil genel amacı geçiş kenar yer değiştirme veya daha yüksek spatio-zamansal çözünürlük hücrelerinin göçmen fenotip çözümlemek için hızlandırılmış görüntüleme için farklı koloni çapı, de tarafından ölçülen hücre yaprak gözlemlemektir.

Hücre göç microenvironmental yardımlar kemokinler, sitokinler ve büyüme faktörleri gibi EGF gibi çeşitli tarafından etkilenebilir. EGF üzerinden bağlayıcı için onun reseptör, EGF reseptör⁹, biyolojik etkileri giderek artan ve invaziv ve metastatik tümör hücreleri^4,9,10davranışını artan bir büyüme faktörüdür. Burada, nokta tahlil incelemek için kullanılır EGF uyarılmış bir insan invaziv, akciğer kolonisi meme kanseri hücre satırı (MCF10CA1a)^8,11,12oluşturan hücre göç.

Protokol

1. kaplama yemekleri (1 gün)

Not: parmak izi ya da kir Kalenin dibinde bu işlerken bırakmamaya dikkat edin.

1. Fare kollajen IV buz çözme ve 3 mL 10 µg/mL kollajen IV çözeltisi hazırlamak için 50 mM HCl (pH 1.3) ile sulandırmak.
   Not: Kollajen 37 ° C'de çökelti Bu nedenle kollajen çözüm ise çözülme ve bu modülle çalışmanın bir düşük sıcaklıkta tutmak önemlidir. Uygun büyüklükteki aliquots hazırlayarak tekrarlanan donma-çözülme döngüsü önlemek ve onları-80 ° C'de depolama
2. 12-şey cam alt plakanın her şey için 250 µL kollajen IV çözüm ekleyin ve uygun ölçekli, kapanış sıkı bir plastik kutuya koyun. Islak kağıt havlu üzerinde ve çevresinde plakaları nemli bir odası imalatı ve kutusunu kapatmak yerleştirin. Gecede, oda sıcaklığında plakaları kuluçkaya.
   Not: olarak sadece büyüme alanı kaplı olması gerekiyor, bu yalnızca alt plaka kollajen çözüm ile bağlı olduğu kapak notu karşılamak için yeterli olur ( şekil 1A, B bir şematik plaka için bakınız).
3. Ertesi sabah, iki kez absorbe olmayan kollajen ve tampon kaldırmak için deiyonize H₂O ile plakalar durulayın. Su iyi değil (su sıçrama bu alana pipetted ise) plaka alt ve coverslip tarafından kurulmuş kenarına plaka kenarına doğrudan. Tabakalar laminar akış başlıklı kuruması. Tabak hemen kullanın veya 4 ° C'de 5 güne kadar saklayın.
   Not: Farklı kaplama, fibronektin veya kollajen gibi ben farklı hücre hatları gerektirebilir.

2. nokta tahlil (2 gün) kaplama

1. Hücre süspansiyon hazırlama
   1. Hücre süspansiyon hazırlamak için 60 mm doku kültürü çanak ile % 5 at serum % 80 izdiham için takıma DMEM/F12 orta artış var hücreleri kullanın.
   2. Kalsiyum ve magnezyum ücretsiz Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) içeren hücreleri bir kez durulama, 500 µL tripsin-EDTA (oda sıcaklığında) ekleyin ve 3-5 dk 37 ° C, % 5 CO₂, oksijen atmosfere bir kuluçka için hücreleri kuluçkaya.
   3. 4.5 mL kültür tripsin etkinliğini durdurur ve bir 20 Say için orta müstakil hücrelerde askıya µL aliquot bir hemasitometre hücre süspansiyon.
   4. Tarafından Santrifüjü 200 x g 3 dk de 15 mL konik tüp içinde kalan hücreleri cips, süpernatant Aspire edin ve kültür orta 3 x 10⁶ hücre/mL olarak hücrelerde resuspend.
      Not: diğer kaplama Substratları ve/veya hücre satırları için optimum hücre yoğunluğu seyreltme serideki oluşturulmalıdır. 3 x 10⁶ hücre/mL başlangıç noktası olarak önerilir.
2. Kaplama hücreleri
   1. Yer hücre süspansiyon kollajen IV her kapak kayma ortasındaki bir 10 µL damla 12-şey cam alt plaka dokunmadan veya kaplama (şekil 1A, B) tırmalamak kaplı. 30 dk 37 ° c, oksijen atmosfere hücreleri eklemek izin vermek için plaka kuluçkaya. Bir ters mikroskobu hücreleri bağlı olduğu kontrol edin.
      Not: Bu en iyi damla, kenarında nerede bir monolayer oluşumu (şekil 1C) gözlenen görülebilir. Gerekirse, plaka kadar kuluçkaya 3 h. damla hızlı bir şekilde kuru olabilir gibi nem kuluçka kadar yüksek olduğunu emin olun. Damla birimin bir azalma bu adımı sırasında gözlenen, PBS nem oranı artırmak için kuyu arasında boşluk ekleyin.
   2. Yavaşça wells kültür iki kez ekli olmayan hücreleri kaldırmak için orta 1 mL ile yıkayın. 1 mL kültür orta her şey için ekleyin. Bir ters mikroskobu kontrol kayan hiçbir hücre kalır, aksi takdirde kuyuları tekrar yıka. Gecede, 37 ° C, % 5 CO₂, oksijen atmosfer iyi tanımlanmış hücre yaprak elde etmek için hücreleri kuluçkaya.
      Not: Yüzen hücreleri yeniden plakasına eklemek ve istenmeyen hücre kolonileri kurmaya muhtemeldir.

3. uyarıcı hücreleri (3. gün)

1. Bütün wells kolonileri düzgün büyüdü o hücreye sağlamak için ters bir mikroskop kullanarak kontrol edin. Gerekirse, uygun olmayan wells işaretlemek ve bunları kullanmayın.
2. Her şey uygun bir şekilde araştırıldı her koşul için plaka etiketleyin. Her koşul yinelenen veya nüsha çalıştırın.
3. DMEM/F12 %0,1 at serum (Aç orta) içeren hücrelerde açlıktan için orta değiştirmek 3 h önce hücreleri uyarılır.
4. Hücreleri EGF (5 ng/mL nihai toplama) eklenmesi veya istenilen başka arabulucu tarafından teşvik ve karışımı yavaşça 1 mL micropipettor kullanarak orta veya plaka dönen tarafından.
5. Plaka kenar deplasman ve kenar kontur 4.1 bölümünde açıklandığı gibi gözlemlemek 1-4 gün kuluçkaya veya 4.2 bölümünde açıklandığı gibi hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirmek.

4. hücre kolonileri ve hücre göç görselleştirme

1. Hematoksilen-koloni büyüme (4-7 gün) ölçmek için boyama Eozin (o)
   1. % 70 etanol (1 mL/de) ~ 2 min için hücrelerde düzeltmek.
   2. Çekirdeklerin Hematoksilen (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.
   3. Musluk suyu (1 mL/de) çekirdeği kadar yıkama hücrelerle mavi, 5-10 dak.
   4. Sitoplazma Eozin (1 mL/de), ~ 2 dk ile leke.
   5. Deiyonize su (1 mL/de) ile durulayın.
      Not: Hematoksilen Eozin çözümler toplanan ve boyama zayıf hale gelinceye kadar birden çok kez kullanılan.
   6. Plaka kuruması.
   7. Plaka çevirmek ve bir cetvel ile nokta çapı ölçmek. Alternatif olarak, Resimler plaka kamera ile fotoğraf çekip ImageJ nokta çapı analiz.
2. Hızlandırılmış mikroskobu (3. gün)
   1. Kuluçka makinesi mikroskobunun geçin ve 37 ° c sıcaklık ayarlama Nemlendirici dH₂O. küçültme/büyütme CO_%2 5 ile doldurun. Kuluçka odası nemlendirilmelidir ve motorlu sahne özgürce hareket edebilirsiniz olun. Kuluçka odası kapatın ve 37 ° C'ye ayarlamak mikroskop izin
      Not: Mikroskop (malzemeleri tablo görmek) kullanılan hücreleri odak sürüklenen önlemek için yansıma önce burada 37 ° c en az 3 h için ısıtmalı olabilir.
   2. Plaka kuluçka mikroskop sahnesinde yerini ve sahne liste oluşturma. Görüntü iki karşıt kenarları ve her hücre nokta (şekil 1A) merkezi.
   3. Görüntüler her 3 dk, 15-24 h 10 X amacı istimal için tutar. Veri indirme ve görüntü analizi tercih, bir programda devam örneğin, ImageJ veya Matlab.

Sonuçlar

Burada sunulan (şekil 1) nokta tahlil invaziv, kullanarak gerçekleştirilen bir modeli sistem olarak meme kanseri hücreleri (MCF10CA1a) oluşturan akciğer koloni. Yeni başlayanlar, yapım o a uygun elinde bile son derece tekrarlanabilir hücre nokta nokta tahlil verimleri ve tahlil (şekil 1D) yürütmek kolay. O boyama veya hızlandırılmış görüntüleme nokta tahlil Birleşik ve sonraki partikül imaj ...

Tartışmalar

Uzak doku çevreleyen doku istila ve uzak siteleri¹⁵' e metastaz kökenli tümör ilerleme hücreleri sırasında geçirilir. Geçiş hücre hücre koloni uzak nokta assay olarak görülebilir. Burada, nokta tahlil insan meme kanseri hücrelerinin yanıt EGF olarak göçmen fenotip analiz ederek gösterilmektedir.

Nokta up birkaç adımda doğru ve yinelenebilir sonuçları elde etmek için deneyleri kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kaplama plaka olmadığını ve g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)