Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

Резюме

Миграции клеток имеет важное значение для развития, ткани технического обслуживания и ремонта и tumorigenesis и регулируется chemokines факторов роста и цитокинов. Этот протокол описывает точка assay, двухмерный, неограниченной миграции пробирного для оценки миграционных фенотип вложения, сплоченной ячеек листов в ответ на microenvironmental подсказки.

Аннотация

Хотя статические сложных организмов, их тканей находятся под непрерывный оборот. Как клетки возраст, умирают и они заменены новых клеток, клеток в тканях плотно организовали способом перемещать. Во время развития опухоли это равновесие нарушается, и оставить опухолевых клеток эпителия происхождения вторгнуться местные микроокружения, поездки в отдаленные места и в конечном счете формируют метастатические опухоли на удаленных объектах. Assay точка относится простой, двумерные неограниченной миграции, для оценки чистого движения ячеек листов в зоне клеток и проанализировать параметры миграции клеток с использованием промежуток времени визуализации. Здесь, точка assay демонстрируется с использованием человека инвазивные, легких колонии, образуя линию клеток рака молочной железы, MCF10CA1a, анализ миграционных ответ клетки на эпидермального фактора роста (EGF), который известен увеличить потенциал злокачественных клеток рака молочной железы и для изменения миграционных фенотипа клетки.

Введение

Анализов миграции широко используются для оценки инвазивных и метастатического потенциала опухоли клетки в пробирке. Чаще всего раны или скретч анализа используется для оценки миграции эпителиальных листов в ячейки очистили площадь^1,2,3. Чтобы выполнить скретч assay, клетки покрыты в монослое и «нуля» или ячейки свободно OBLASTь создается с кончиком пипетки. Царапины легко настроить с общедоступными культуры ткани поставок и может осуществляться в нескольких хорошо пластины, позволяя для обработки нескольких образцов. Однако как царапины, клетки физически удаляются из монослоя и часто проходят смерти клетки. Кроме того внеклеточного матрикса, прикреплены к плите часто повреждены во время процесса царапин. Аналогично, использование кремния вставляет (например, Ibidi камер⁴) или трафаретов^5,6,7 может привести к механическое разрушение клеток и частичное удаление матрицы белков используется для покрытия плиты. Еще одним недостатком анализов, мониторинг закрытие раны или царапин является их ограниченного времени курс, как миграции клеток могут быть проанализрованы лишь до нуля закрыт.

При выполнении точка assay, клетки покрыты как круговой колонии на пластины с покрытием или без покрытия⁸. Обоснование этой стратегии покрытия является получение ячеек листов с определенными краями, которые можно перенести или вторгнуться в прилегающих районах, свободных клеток не нарушая культуры путем удаления клеток или вставки. Общая цель пробирного точка является соблюдать миграции клеток листов как измеряется края перемещения или диаметр колонии, а также выполнять покадровый визуализации для анализа миграционных фенотипа клетки в пространственно временным разрешением.

Миграции клеток могут быть затронуты различные microenvironmental подсказки как chemokines, цитокинов и факторы роста, такие как EGF. EGF-это фактор роста, что оказывает его биологические эффекты через привязку к своим рецептором, EGF рецептор⁹и увеличивает инвазивных и метастатические поведение опухоли клетки^4,9,10. Здесь, пробирного точка используется для изучения EGF стимулировали миграции клеток колонии человека инвазивные, легкого формирования груди рак клеток линии (MCF10CA1a)^8,11,12.

протокол

1. покрытие блюд (1 день)

Примечание: Не забудьте оставить отпечатки пальцев или грязь на нижней части пластины при обращении с ней.

1. Размораживание мыши коллаген IV на льду и разбавить 50 мм HCl (рН 1.3) подготовить 3 мл раствора 10 мкг/мл коллаген IV.
   Примечание: Коллаген будет выпадать в осадок при 37 ° C. Поэтому важно, чтобы коллагена раствор при низкой температуре во время работы с ним и оттаивания. Избегать повторного замораживания оттаивания циклы подготовки соответствующего размера аликвоты и хранение их в-80 ° C.
2. Добавить 250 мкл коллаген IV решение в каждой скважине 12-ну стекла дно и поместите их в соответствующего размера, плотно закрывающиеся пластиковой коробке. Место влажной салфеткой над и вокруг пластин для производства влажных камеры и закрыть окно. Инкубируйте пластины на ночь при комнатной температуре.
   Примечание: Как только области роста должна быть покрыты, это достаточно, чтобы охватывать только крышка выскальзования, который прикреплен к нижней части пластины, с коллагена раствор (см. Рисунок 1A, B для схема плиты).
3. Следующее утро промойте пластины с дейонизированной H₂O дважды, чтобы удалить не поглощается коллагена и буфера. Направляйте воду до края плиты, хорошо, не к краю образованного нижней пластины и coverslip (если вода накапаны в этой области, которую он будет плескаться). Просушите и пластины в Ламинарный шкаф. Сразу использовать плиты или хранить при 4 ° C на срок до 5 дней.
   Примечание: Может потребоваться различных клеточных линий, различных покрытий, например фибронектин или коллагена я.

2. покрытие Assay Dot (день 2)

1. Подготовка суспензию клеток
   1. Для приготовления суспензии клеток, используйте клетки, которые были выросли в культуре ткани 60-мм блюдо в среде DMEM/F12 дополнена сыворотки крови лошади 5% до 80% слияния
   2. Один раз ополосните клетки с свободного кальция и магния Дульбекко фосфатный буфер (DPBS), добавить 500 мкл трипсина ЭДТА (комнатной температуры) и инкубации клеток для 3-5 мин в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO₂, увлажненные атмосферу.
   3. Приостановить отдельные ячейки в 4,5 мл питательной среды для остановки активности трипсина и рассчитывать 20 мкл Алиготе суспензию клеток в Горяева.
   4. Пелле оставшиеся ячейки в 15 мл Конические трубки центрифугированием при 200 g x 3 мин, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в культуре средне-3 х 10⁶ клеток/мл.
      Примечание: Для других покрытие подложек и/или клеточных линий, плотность оптимальной клеток должны создаваться в серии разрежения. в качестве отправной точки рекомендуется 3 х 10⁶ клеток/мл.
2. Покрытие клетки
   1. Место падение 10 мкл суспензии клеток в центре каждого крышка выскальзования коллаген IV покрытием стекла 12-ну нижней плиты без прикосновения или царапин покрытие (рис. 1A, B). Инкубируйте пластину на 30 минут при 37 ° C, увлажненные атмосферу, чтобы позволить клетки для присоединения. Проверьте в инвертированным микроскопом клетки прилагаются.
      Примечание: Это лучше всего видно на крае падения, где формирование монослоя может наблюдаться (рис. 1C). При необходимости, инкубировать пластины до 3 ч. Будьте уверены, что влажность воздуха в инкубаторе является достаточно высоким, как капли могут высыхать быстро. Если наблюдается сокращение объема падение во время этого шага, добавьте PBS в промежутках между скважин для увеличения влажности воздуха.
   2. Осторожно промойте лунки с 1 мл питательной среды дважды, чтобы удалить не придает клетки. Добавьте 1 мл питательной среды в каждой скважине. Регистрация инвертированным микроскопом, что нет плавающей клетки остаются, иначе снова помойте скважин. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C, 5% CO₂, увлажненные атмосферу, чтобы получить четко определенных ячеек листов.
      Примечание: Плавающие клетки, вероятно, чтобы повторно присоединить к пластине и сформировать нежелательных клеток колонии.

3. стимулирование клеток (день 3)

1. Проверьте все скважины с использованием инвертированный микроскоп для обеспечения этой ячейки, которую колоний выросли должным образом. При необходимости, Марк неподобающе скважин и не использовать их.
2. Этикетке каждой скважины пластины надлежащим образом для каждого условия расследование. Запустите каждое условие в двух экземплярах или в трех экземплярах.
3. Изменение среднего голодать клеток в среде DMEM/F12, содержащие 0,1% лошадь сыворотки (голодающую средний) 3 ч до стимулируются клетки.
4. Стимулируют клетки с добавлением EGF (конечная концентрация 5 нг/мл) или других желаемых посредников и осторожно перемешать носитель, с помощью micropipettor 1 мл или закрученной пластину.
5. Инкубировать пластину для 1-4 дней наблюдать смещение кромки и края контура, как описано в разделе 4.1 или выполнять покадровый изображений, как описано в разделе 4.2.

4. Визуализация колоний клеток и клеток миграции

1. Гематоксилином эозином, (он) пятная для измерения роста колонии (4-7 день)
   1. Исправьте клетки в 70% этанола (1 мл/хорошо) ~ 2 мин.
   2. Пятно ядер с гематоксилином (1 мл/а), ~ 2 мин.
   3. Вымыть клетки с водопроводной водой (1 мл/хорошо) до ядра являются синий, 5-10 мин.
   4. Цитоплазма пятно с эозином (1 мл/а), ~ 2 мин.
   5. Ополосните деионизированной водой (1 мл/хорошо).
      Примечание: Гематоксилином и эозином решения могут быть собраны и использованы несколько раз до тех пор, пока окрашивание становится слабым.
   6. Воздушно-сухой плиты.
   7. Флип пластину и измерить диаметр точка с правителем. Кроме того принимать фотографии пластины с камерой и анализировать точка диаметра в ImageJ.
2. Покадровой микроскопии (день 3)
   1. Переключитесь на микроскопе инкубатора и отрегулировать температуру до 37 ° C. Заполните увлажнитель с dH₂O. Adjust CO₂ до 5%. Убедитесь, что палата инкубатор увлажняется и что моторизованного столика можно свободно перемещать. Закрыть камеру инкубатора и позволяют Микроскоп, чтобы приспособиться к 37 ° C.
      Примечание: Микроскоп (см. таблицу материалы) используется здесь должна быть нагрета до 37 ° C, по крайней мере 3 часа, прежде чем клетки отражаются во избежание Дрифтинг Фокус.
   2. Установите пластину на сцене в инкубатор микроскоп и настройте стадии список. Центр каждой ячейки точки (рис. 1A) и два противоположных краев изображения.
   3. Возьмите изображения каждые 3 минуты, 15-24 часа с помощью 10 X цель. Загрузка данных и продолжить анализ изображений в программе выбора, например, ImageJ или Matlab.

Результаты

Assay точка, представленные здесь (рис. 1) была выполнена с помощью инвазивных, легких колонии, формирование клеток рака молочной железы (MCF10CA1a) в качестве модели системы. Assay точка дает высокую воспроизводимость ячейки точки даже в руки новичков, что делает...

Обсуждение

Во время прогрессии опухоли клетки мигрируют от ткани происхождения вторгнуться в окружающие ткани и метастазировать в отдаленные участки¹⁵. Миграции клеток от колонии клеток может наблюдаться в assay точка. Здесь точка assay свидетельствует анализ миграционных фенотипа клет?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)