Utilisant le test de Dot pour analyser la Migration des cellules feuilles

Résumé

La migration cellulaire est essentielle pour le développement, la maintenance du tissue et réparation et tumorigenèse et est régulée par des facteurs de croissance, cytokines et chimiokines. Ce protocole décrit le dosage de la dot, une analyse bidimensionnelle, sans contrainte de migration afin d’évaluer le phénotype migrateur de feuilles de cellule cohésive, attaché en réaction aux signaux micro-environnementales.

Résumé

Bien que des organismes complexes apparaissent statiques, leurs tissus subissent une rotation continue. Comme les cellules âge, meurent et sont remplacées par de nouvelles cellules, cellules se déplacent dans les tissus d’une manière bien orchestrée. Au cours du développement de la tumeur, cet équilibre est perturbé, et les cellules tumorales quittent l’épithélium d’origine pour envahir le microenvironnement local, se rendre dans des endroits éloignés et pour finalement former des tumeurs métastatiques dans des sites éloignés. L’essai de la dot est un test simple, deux dimensions de la migration sans contrainte, pour évaluer le mouvement net de feuilles de cellule dans une zone acellulaire et d’analyser les paramètres de la migration cellulaire à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Ici, le dosage de la dot est démontré à l’aide un homme envahissante, la colonie de poumon formant la lignée de cellules de cancer du sein, MCF10CA1a, pour analyser la réponse migratoire LiPo au facteur de croissance épidermique (EGF), qui est connu pour augmenter le potentiel maligne de cellules cancéreuses du sein et pour modifier le phénotype migratoire des cellules.

Introduction

Les essais de migration sont largement utilisés pour évaluer le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales in vitro. Le plus souvent, la blessure ou le zéro dosage sert à évaluer les migration des feuilles épithéliales dans une cellule effacée zone^1,2,3. Pour effectuer le test de gratter, les cellules sont plaqués en une monocouche et un « scratch » ou zone acellulaire est créé avec un embout de la pipette. Le test de scratch est facile à configurer avec fournitures de vitroplants couramment disponible et peut être effectué en plaques multipuits, permettant ainsi à la transformation de plusieurs échantillons. Cependant, comme le scratch est fait, les cellules sont physiquement supprimées de la monocouche et souvent subir une mort cellulaire. En outre, fixée à la plaque de la matrice extracellulaire est souvent endommagée pendant le processus de se gratter. De même, l’utilisation de silicium insère (comme Ibidi chambres⁴) ou des pochoirs^5,6,7 peut conduire à une rupture mécanique des cellules et l’élimination partielle des protéines de la matrice utilisée pour le revêtement de la plaques. Un autre inconvénient des essais de contrôle de fermeture des plaies ou égratignures est leur cours de durée limitée, comme la migration cellulaire seulement peut être analysée jusqu'à la fermeture de l’éraflure.

Dans la réalisation de l’essai de la dot, les cellules sont plaqués comme une colonie circulaire sur une plaque revêtues ou non revêtues⁸. La justification de cette stratégie de placage est d’obtenir des feuilles de cellule avec bords définis, qui peuvent migrer ou envahir dans les environs d’acellulaire sans perturber la culture par prélèvement de cellules ou d’inserts. L’objectif global de l’essai de la dot est d’observer la migration des feuilles de cellule, telle que mesurée par le déplacement de bord ou le diamètre des colonies, ainsi qu’effectuer une imagerie Time-lapse pour analyser le phénotype migratoire des cellules en plus haute résolution spatio-temporelle.

La migration cellulaire peut être affectée par une variété de signaux micro-environnementales comme facteurs de croissance tels que l’EGF, cytokines et chimiokines. EGF est un facteur de croissance qui exerce ses effets biologiques via la liaison à son récepteur, le récepteur EGF⁹et augmente le comportement envahissant et métastatique des tumeurs des cellules^4,9,10. Ici, le test de point est utilisé pour étudier EGF stimulée la migration cellulaire dans une colonie de poumon humain envahissantes, formant breast cancer cell line (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocole

1. revêtement de plats (jour 1)

Remarque : Veillez à ne pas laisser des empreintes digitales ou la saleté sur le bas de la plaque lors de la manipulation il.

1. Décongeler le collagène IV sur la glace de la souris et le diluer avec HCl (pH 1.3) 50 mM pour préparer 3 mL d’une solution de IV 10 µg/mL collagène.
   NOTE : Collagène précipitera à 37 ° C. Il est donc important de garder la solution du collagène à basse température en fonte et en travaillant avec elle. Éviter les cycles de gel-dégel répétés en préparant des aliquotes de tailles appropriée et leur stockage à-80 ° C.
2. Ajouter 250 µL de solution de collagène IV dans chaque puits de plaques de verre de 12 puits à fond et rangez-les dans une boîte en plastique de taille appropriée, fermeture étanche. Placer une serviette en papier humide au-dessus et autour des plaques pour fabriquer une chambre humide et fermer la boîte. Incuber les boîtes pendant une nuit à température ambiante.
   Note : Que seule la zone de croissance doit être revêtu, il est suffisant pour couvrir uniquement la lamelle couvre-objet, qui est attaché au bas de la plaque, avec une solution de collagène (voir Figure 1A, B pour un schéma de plaque).
3. Le lendemain matin, rincer les plaques avec désionisée H₂O deux fois pour retirer le tampon et le collagène non absorbé. Diriger l’eau vers le bord de la plaque bien, non pas sur le bord formé par le fond de la plaque et le couvre-objet (si l’eau est reversé dans ce domaine qu'il éclaboussera). Sécher les plaques dans la hotte à flux laminaire. Utilisez les plaques immédiatement ou conserver à 4 ° C pendant 5 jours.
   Remarque : Les différentes lignées cellulaires peuvent nécessiter différents revêtement, telles que la fibronectine ou collagène I.

2. plaquant le dosage de la Dot (jour 2)

1. Préparation de la suspension cellulaire
   1. Pour préparer la suspension cellulaire, utiliser des cellules qui ont été cultivées dans un plat de vitroplants de 60 mm dans le milieu DMEM/F12 additionné de 5 % de sérum de cheval à la confluence de 80 %
   2. Rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco exempts de calcium et de magnésium (SPD) une fois, ajouter 500 µL trypsine-EDTA (température ambiante) et incuber les cellules pendant 3-5 min dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée.
   3. Suspendre les cellules individuelles dans 4,5 mL de milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et compter 20 quantité µL de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre.
   4. Le reste des cellules dans un tube conique de 15 mL de granule par centrifugation à 200 x g pendant 3 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture à 3 x 10⁶ cellules/mL.
      Remarque : Pour les autres substrats de revêtement et/ou de lignées cellulaires, la densité cellulaire optimale doit être établie dans une série de dilutions. 3 x 10⁶ cellules/mL est recommandé comme point de départ.
2. Cellules de placage
   1. Place une baisse de 10 µL de suspension cellulaire au centre de chaque lamelle couvre-objet du collagène IV enduit plaque de fond de verre de 12 puits sans toucher ni rayer le revêtement (Figure 1A, B). Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C, une atmosphère humidifiée, pour permettre les cellules attacher. Dans un microscope inversé s’assurer que les cellules sont accrochés.
      Remarque : Ceci peut être mieux vu au bord de la goutte, où la formation d’une monocouche peut être observée (Figure 1C). Si nécessaire, incuber la plaque jusqu'à 3 h. Veillez à ce que l’humidité dans l’incubateur est suffisamment élevée, comme les gouttes peuvent sécher rapidement. Si on observe une réduction du volume baisse au cours de cette étape, ajouter PBS aux espaces entre les puits pour augmenter l’humidité.
   2. Laver délicatement les puits avec 1 mL de milieu de culture deux fois pour éliminer les cellules non inscrits. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans chaque puits. Vérifier dans un microscope inversé qu’aucune cellule flottante restent, sinon laver les puits à nouveau. Incuber les cellules durant la nuit à 37 ° C, 5 % de CO₂, atmosphère humidifiée, pour obtenir des feuilles de cellule bien définis.
      Remarque : Les cellules flottant risquent à recoller la plaque et à former des colonies de cellules indésirables.

3. stimulation des cellules (jour 3)

1. Vérifier tous les puits à l’aide d’un microscope inverse pour s’assurer que la cellule colonies ont bien grandi. Le cas échéant, marquer puits inadaptées et ne les utilisent pas.
2. Étiquetez chaque puits de la plaque de manière appropriée pour chaque condition étudiée. Exécuter chaque condition en double ou triple exemplaire.
3. Changer le milieu affamer les cellules en DMEM/F12 contenant 0,1 % de sérum de cheval (milieu affamé) 3 h avant que les cellules sont stimulées.
4. Stimuler les cellules par addition de l’EGF (concentration finale de 5 ng/mL) ou d’autres médiateurs désirés et mélanger délicatement le support à l’aide d’une micropipette de 1 mL ou en agitant la plaque.
5. Incuber les plaques pour 1 à 4 jours observer le déplacement de bord et de contour bord tel que décrit à la section 4.1 ou effectuer une imagerie Time-lapse comme décrit à la section 4.2.

4. visualisation des Colonies cellulaires et Migration cellulaire

1. L’hématoxyline-éosine (HE) souillure pour mesurer la croissance des colonies (4-7 jours)
   1. Fixer les cellules dans l’éthanol à 70 % (1 mL/puits) pendant environ 2 min.
   2. Tacher les noyaux avec l’hématoxyline (1 mL/puits), environ 2 min.
   3. Les cellules laver avec l’eau du robinet (1 mL/puits) jusqu'à ce que les noyaux sont bleus, 5-10 min.
   4. Tache de cytoplasme avec l’éosine (1 mL/puits), environ 2 min.
   5. Rincer à l’eau désionisée (1 mL/puits).
      Remarque : L’hématoxyline et éosine solutions soient collectées et utilisées plusieurs fois jusqu'à ce que la coloration devient faible.
   6. Sécher la plaque.
   7. Retournez la plaque et mesurer le diamètre de la dot avec une règle. Vous pouvez également prendre des photos de la plaque avec une caméra et d’analyser le diamètre de la dot dans ImageJ.
2. Time-lapse microscopie (jour 3)
   1. Allumer le microscope de l’incubateur et ajuster la température à 37 ° C. Remplir l’humidificateur avec dH₂O. réduire/agrandir le CO₂ à 5 %. S’assurer que la chambre de l’incubateur est humidifiée et que la platine motorisée peut se déplacer librement. Fermer la chambre de l’incubateur et permettre au microscope pour s’adapter à 37 ° C.
      Remarque : Le microscope (voir la Table des matières) utilisé ici doit être chauffé à 37 ° C pendant au moins 3 h avant que les cellules sont imagés pour éviter les dérives de la mise au point.
   2. Placer la plaque sur la scène du microscope incubateur et mettre en place la liste de l’étape. Deux bords opposés de l’image et le centre de chaque point de la cellule (Figure 1A).
   3. Prendre des photos toutes les 3 min, de 15 à 24 h à l’aide de l’objectif 10 X. Télécharger les données et de procéder à l’analyse d’image dans un programme de choix, par exemple, ImageJ ou Matlab.

Résultats

L’essai de point présenté ici (Figure 1) a été réalisée par envahissantes, formant des cellules de cancer du sein (MCF10CA1a) comme système modèle des colonies de poumon. Le dosage de la dot donne des points de cellules hautement reproductible même dans la main de débutants, ce qui en fait un moyen pratique et facile à exécuter le test (Figure 1D). Le test point combiné avec il coloration ou Time-l...

Discussion

Les cellules tumorales progression migrent vers loin le tissu d’origine à envahir les tissus environnants et à métastaser dans des endroits éloignés,¹⁵. Migration des cellules d’une colonie de cellules peut être observée dans l’essai de la dot. Ici, le dosage de la dot est illustré en analysant le phénotype migratoire des cellules cancéreuses du sein humain en réponse à l’EGF.

Pour obtenir des résultats exacts et reproductibles plusieurs étapes dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)