Mit Hilfe der Dot-Assay, Migration der Zelle Blätter zu analysieren

Zusammenfassung

Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.

Zusammenfassung

Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.

Einleitung

Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich^1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen "Kratzer" oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitung mehrerer Proben durchgeführt werden kann. Jedoch da der Kratzer hergestellt wird, Zellen sind physisch aus der Monolage entfernt und oft durchlaufen Zelltod. Extrazellulärer Matrix an der Platte befestigt ist darüber hinaus oft kratzen dabei beschädigt. Ebenso die Verwendung von Silizium wird eingefügt (z. B. Ibidi Kammern⁴) oder Schablonen^5,6,7 zu mechanischen Störungen der Zellen und der teilweisen Entfernung der Matrixproteine Beschichtung führen die Platten. Ein weiterer Nachteil von Assays Überwachung Verschluss von Wunden oder Kratzer ist ihre begrenzte Zeit natürlich da Zellwanderung nur analysiert werden kann, bis der Kratzer geschlossen wird.

Bei der Durchführung des Dot-Tests, sind Zellen als eine kreisförmige Kolonie auf einer beschichteten oder unbeschichteten Platte⁸vergoldet. Die Gründe für diese Beschichtung-Strategie soll Zelle Blätter mit definierten Kanten zu erhalten, die dringen in die Zelle-freie Umgebung ohne zu stören die Kultur durch Abbau von Zellen oder Beilagen oder migrieren können. Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist Migration der Zelle Blätter gemessen am Rande Verschiebung oder Kolonie Durchmesser, sowie hinsichtlich durchführen, Time-Lapse imaging zu analysieren, die wandernden Phänotyp der Zellen in räumlich-zeitliche Auflösung beobachten.

Zellwanderung kann durch eine Vielzahl von microenvironmental Signale wie Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wie EGF beeinträchtigt werden. EGF ist ein Wachstumsfaktor, der übt seine biologische Wirkung über Bindung an seinen Rezeptor EGF-Rezeptor-⁹, und invasive und metastasierten Verhalten von Tumor Zellen^4,9,10erhöht. Hier ist der Dot-Test zur Untersuchung EGF stimuliert Zellwanderung in eine menschliche invasive, Lunge koloniebildenden Brust Krebs Zelle Linie (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protokoll

(1) Beschichtung der Gerichte (Tag 1)

Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, Fingerabdrücke oder Schmutz auf der Unterseite der Platte zu verlassen, beim Umgang.

1. Tauen Sie Maus Kollagen IV auf Eis auf, und verdünnen Sie es mit 50 mM HCl (pH 1.3) um 3 mL einer 10 µg/mL Kollagen IV Lösung vorzubereiten.
   Hinweis: Kollagen wird Niederschlag bei 37 ° C. Es ist daher wichtig, die Kollagen-Lösung bei niedriger Temperatur zu halten, beim Auftauen und mit ihm arbeiten. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln durch die Vorbereitung entsprechend dimensionierte Aliquote und speichert sie bei-80 ° C.
2. Jede Vertiefung des 12-Well Glas Bodenplatten 250 µL Kollagen IV Lösung hinzu, und legen Sie sie in eine entsprechend dimensionierte, dicht schließender Kunststoff-Box. Feuchten Papiertuch über und um die Platten für die Herstellung einer feuchten Kammer und schließen Sie das Feld zu platzieren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
   Hinweis: Da nur das Wachstumsfeld werden beschichtet muss, es ist ausreichend, nur das Deckglas abdecken, die an der Unterseite der Platte, die mit Kollagen-Lösung verbunden ist (siehe Abbildung 1A, B für eine schematische Darstellung der Platte).
3. Am nächsten Morgen spülen Sie Platten mit entionisiertem H₂O zweimal, nicht absorbiert Kollagen und Puffer zu entfernen. Richten Sie das Wasser an den Rand der Platte gut, nicht an den Rand von Platte unten und das Deckglas (wenn Wasser in diesem Bereich können sie Spritzen wird pipettiert) gebildet. Trocknen Sie die Platten in der Laminar-Flow-Haube an der Luft. Platten sofort verwenden oder für bis zu 5 Tage bei 4 ° C lagern.
   Hinweis: Verschiedene Zelllinien benötigen unterschiedliche Beschichtung, z. B. Fibronektin oder Kollagen ich.

(2) Beschichtung der Dot-Assay (Tag 2)

1. Vorbereitung der Zellsuspension
   1. Zur Vorbereitung der Zellsuspension verwenden Sie Zellen, die angebaut wurden in einer 60 mm Gewebe Kulturschale in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum zu 80 % Zusammenfluss ergänzt
   2. Spülen Sie die Zellen mit Kalzium und Magnesium-freie Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) einmal fügen Sie 500 µL Trypsin-EDTA (Raumtemperatur hinzu) und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 min. im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO₂, feuchte Atmosphäre.
   3. Aussetzen der freistehenden Zellen in 4,5 mL Kulturmedium zu stoppen Trypsin Aktivität und zählen eine 20 µL aliquoten die Zellsuspension in eine Hemocytometer.
   4. Pellet-die restlichen Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 X g 3 min, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in Kulturmedium bis 3 x 10⁶ Zellen/mL.
      Hinweis: Für andere Beschichtung Substraten und/oder Zelllinien, muss die optimale Zelldichte in einer Verdünnungsreihe hergestellt werden. 3 x 10⁶ Zellen/mL empfiehlt sich als Ausgangspunkt.
2. Galvanischen Zellen
   1. Statt einen Tropfen 10 µL Zellsuspension in der Mitte der einzelnen Deckglas des Kollagen IV beschichtet 12-Well Glas Bodenplatte ohne berühren oder kratzen die Beschichtung (Abbildung 1A, B). Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C, feuchte Atmosphäre, damit die Zellen befestigen. Check-in einem inversen Mikroskop, dass die Zellen verbunden sind.
      Hinweis: Dies kann am besten gesehen werden am Rand des Tropfens, wo kann Bildung von einem monomolekularen Film (Abbildung 1C) beobachtet werden. Bei Bedarf, brüten die Platte bis zu 3 h. sicher sein, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch genug ist, wie die Tropfen schnell austrocknen können. Wird eine Reduzierung des Volumens Tropfen während dieses Schritts eingehalten, fügen Sie PBS hinzu, die Zwischenräume zwischen den Brunnen um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen.
   2. Waschen Sie vorsichtig die Brunnen mit 1 mL Kulturmedium zweimal um die fraktionslosen Zellen zu entfernen. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in jede Vertiefung. Check-in einem inversen Mikroskop, dass keine schwimmenden Zellen bleiben, sonst die Brunnen wieder waschen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO₂, befeuchtete Atmosphäre, gut definierte Zelle Blätter zu erhalten.
      Hinweis: Schwimmende Zellen sind wahrscheinlich auf die Platte wieder anzubringen und zu unerwünschten Zelle Kolonien bilden.

3. Förderung der Zellen (Tag 3)

1. Überprüfen Sie alle Brunnen mit einem inversen Mikroskop um diese Zelle sicherzustellen, die Kolonien richtig gewachsen sind. Ggf. Markieren Sie ungeeignete Brunnen und verwenden Sie sie nicht.
2. Beschriften Sie jede Vertiefung der Platte entsprechend für jede Bedingung untersucht. Führen Sie jede Bedingung in doppelt oder dreifach.
3. Ändern Sie das Medium, um die Zellen in DMEM/F12 mit 0,1 % Pferd Serum (hungernden Medium) verhungern 3 h bevor Zellen stimuliert werden.
4. Stimulieren die Zellen durch Zugabe von EGF (Endkonzentration 5 ng/mL) oder andere gewünschte Mediatoren und vorsichtig mischen das Medium mit einer 1 mL Micropipettor oder durch Schütteln der Plattenrandes.
5. Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Tage, Rand Verschiebung und Rand Kontur zu beobachten, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben oder Zeitraffer Bildgebung durchführen, wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.

(4) Visualisierung der Zelle Kolonien und Zellwanderung

1. Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung zur Messung der Koloniewachstum (Tag 4-7)
   1. Zellen in 70 % igem Ethanol (1 mL/Na) für ~ 2 min zu beheben.
   2. Kerne mit Hämatoxylin (1 mL/gut), ~ 2 min. Fleck.
   3. Waschen Zellen mit Leitungswasser (1 mL/Na) bis Kerne sind blau, 5-10 Minuten.
   4. Fleck Zytoplasma mit Eosin (1 mL/gut), ~ 2 min.
   5. Spülen Sie mit entionisiertem Wasser (1 mL/Na).
      Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Lösungen gesammelt und verwendet werden können mehrere Male, bis die Färbung ohnmächtig wird.
   6. Trocknen Sie Platte an der Luft.
   7. Drehen Sie die Platte und gemessen Sie der Punkt-Durchmesser mit einem Lineal. Alternativ die Platte mit einer Kamera fotografieren und analysieren des Punkt-Durchmessers in ImageJ.
2. Zeitraffer-Mikroskopie (Tag3)
   1. Schalten Sie das Inkubator-Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit dH₂O. Adjust CO₂ auf 5 %. Stellen Sie sicher, dass die Inkubator Kammer befeuchtet ist und dass die motorisierte Bühne frei bewegen kann. Die Inkubator-Kammer in der Nähe und lassen Sie das Mikroskop auf 37 ° c einstellen
      Hinweis: Das Mikroskop verwendet (siehe Tabelle Material) hier sollte auf 37 ° C für mindestens 3 h erhitzt werden, bevor die Zellen abgebildet werden, um zu vermeiden, driften die Schärfentiefe.
   2. Die Platte auf der Bühne des Mikroskops Inkubator und richten Sie die Bühne-Liste. Bild zwei gegenüberliegenden Kanten und das Zentrum von jeder Zelle Punkt (Abb. 1A).
   3. Nehmen Sie Bilder alle 3 min für 15-24 h mit 10 X-Objektiv. Laden Sie die Daten und fahren Sie mit Bildanalyse in einem Programm Ihrer Wahl, z.B.ImageJ oder Matlab.

Ergebnisse

Die Dot-Assay präsentiert hier (Abbildung 1) erfolgte mittels invasiver, Lunge koloniebildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) als Modellsystem. Der Dot-Test ergibt hoch reproduzierbare Zelle Punkte selbst in der Hand von Anfängern, so dass es eine bequeme und leicht auszuführende Assay (Abbildung 1D). Die Dot-Assay kombiniert mit er Färbung oder Zeitraffer Bildgebung und nachfolgenden Partikel Image Velocimet...

Diskussion

Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten¹⁵. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.

Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)