ドットの試金を使用して細胞シートの移行を分析するには

要約

細胞遊走は開発、組織のメンテナンスと修復、および腫瘍発生の促進に欠かせない、成長因子、ケモカイン、サイトカインによって調節されています。このプロトコルでは、ドットの試金、アイソレータケージ キューに応答に接続されている、まとまりのある細胞シートの渡り鳥の表現型を評価するために二次元、制約のない移行アッセイについて説明します。

要約

複雑な生物は静的に表示が彼らの組織が継続的な売り上げ高の下です。細胞の年齢、死ぬとは新しい細胞に置き換えられて細胞移動組織内でしっかりと管弦楽に編曲された方法で。腫瘍の開発の間にこの平衡が妨げられるし、腫瘍細胞がローカル微小環境、遠いサイトに行き、最終的に遠隔部位に転移性の腫瘍を形成するために侵入するために原産の上皮を残します。ドットの試金はセル フリーエリアに細胞シートの網の動きを評価し、タイムラプス イメージングによる細胞遊走のパラメーターを分析する簡単な二次元の制約のない移行アッセイ。ドット アッセイは実証してここでは、侵襲的人間、肺コロニー形成乳房癌細胞ライン、MCF10CA1a を使用して上皮成長因子 (EGF)、乳癌細胞の悪性の可能性を高めるに知られている細胞の渡り鳥応答を分析して渡り鳥の細胞表現型を変更します。

概要

腫瘍細胞の in vitroの侵襲と転移の可能性を評価する移動分析広く使用されます。よく、傷やスクラッチの試金は上皮シートのセルをオフにエリア^1,2,3への移行を評価するために使用されます。スクラッチのアッセイを行う細胞が単層にメッキされ、ピペット チップ「スクラッチ」または無料のセル領域が作成されます。スクラッチの試金、一般的な培養装置を設定する簡単なウェル プレート、複数のサンプルの処理を可能にするうことができます。ただし、スクラッチでセル単一層から物理的に削除されます、細胞死をしばしば受けます。さらに、細胞外マトリックス プレートに取り付けがしばしばスクラッチ処理中に破損しています。同様に、シリコンの使用を挿入します (たとえば、Ibidi 室⁴) またはステンシルの^5,6,7細胞の機械的崩壊とコーティングに使用されるマトリックス蛋白質の部分的な除去につながることができます、プレート。傷や傷の閉鎖を監視の試金の別の欠点は、スクラッチが閉じられるまで、細胞の移動を分析のみことができます彼らの期間限定コースです。

ドット アッセイを行うセルをコーティングしたまたはコーティング プレート⁸の上に円形のコロニーとしてめっき。このめっき方法の理論的根拠は、移行または挿入またはセルの削除によって文化を乱すことがなく細胞周辺に侵入できる定義されたエッジを持つ細胞シートを取得することです。ドット アッセイの全体的な目標は、移行細胞シート端変位または、同様高い時空間的解像度で細胞の渡り鳥の表現型を解析するタイムラプス イメージングを実行するコロニー径で測定したを観察することです。

細胞遊走はアイソレータケージ手がかり EGF などの成長因子、サイトカイン、ケモカインなどの様々 な影響を受けます。EGF が成長因子、その受容体は、EGF 受容体⁹へのバインディングを介してその生物学的効果を発揮し、腫瘍細胞^4,9,10の侵襲と転移挙動が増加します。ドット試金を研究に使用するここで、EGF は、人間、侵襲性肺コロニー乳房癌細胞ライン (MCF10CA1a)^8,11,12を形成細胞の移動を刺激します。

プロトコル

1. 料理 (1 日目) のコーティング

注: しないように取り扱いにプレートの底に指紋や汚れを残します。

1. マウスのコラーゲン氷の上の IV を解凍し、それを希釈 50 mM HCl (pH 1.3) 10 μ g/mL コラーゲン IV 溶液 3 mL を準備します。
   注: コラーゲンを 37 ° C で沈殿させるしたがって、コラーゲン溶液を低温融解と使用中保つことが重要です。適切なサイズの因数を準備することによって凍結融解の繰り返しを避けるため-80 ° C で保存して
2. 12 ウェル ガラス底板の各ウェルに 250 μ L コラーゲン IV ソリューションを追加し、適切なサイズ、タイトな終了のプラスチック ボックスにそれらを置きます。湿らせたペーパー タオル上と湿気のある商工会議所を製造し、ボックスを プレートの周りに配置します。室温で一晩版を孵化させなさい。
   注: 成長分野だけは塗装する必要がある、それはコラーゲン溶液と、プレートの下部に取り付けられているカバー スリップをカバーするのに十分な (図 1A、Bのために板の回路図を参照してください)。
3. 次の朝は、脱イオン H₂O 2 回非吸収コラーゲンとバッファーを削除するとプレートをすすいでください。まあ、プレート下部に配置され、coverslip によって形成される (場合、水はそれがスプラッシュはこの領域に戻) 端にプレートの端に水を指示します。層流フードに板を風乾します。すぐに板を使用したり、4 ° C で最大 5 日間保存します。
   注: 異なる細胞は異なるコーティング、フィブロネクチン、コラーゲンなど私を必要があります。

2. めっきドット アッセイ (2 日目)

1. 細胞懸濁液を準備します。
   1. 細胞懸濁液を準備するには、5% 80% 合流馬血清を添加した DMEM/F12 中 60 mm 細胞培養用ディッシュで栽培されているセルを使用します。
   2. カルシウムとマグネシウム無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で細胞を濯ぎ 1 回 500 μ L トリプシン-EDTA (常温) を追加し、37 ° C、5% CO₂、加湿雰囲気でインキュベーターで 3-5 分のセルを孵化させなさい。
   3. トリプシン処理を停止し、カウントを 20 4.5 mL 培養液中の剥離細胞を中断、検定に細胞懸濁液の μ 因数。
   4. 3 分間 200 × g で遠心分離によっての 15 mL の円錐管の残りのセルのペレット、上清を吸引、3 x 10⁶セル/mL に培養液中の細胞を再懸濁します。
      注: その他の基材をコーティングや細胞の最適な細胞濃度は希釈系列の確立されなければなりません。3 x 10⁶セル/mL は、出発点として推奨されています。
2. めっきセル
   1. コラーゲン IV の各カバー スリップの中心に細胞懸濁液の 10 μ L のドロップの場所 (図 1A, B) の塗装を傷に触れたりなし 12 ウェル ガラス底板にコーティング。プレートを付けるセルを許可するように、加湿雰囲気 37 ° C で 30 分間インキュベートします。倒立顕微鏡で細胞が接続されているを確認します。
      注: 最高といえる、ドロップの端、単分子膜の形成は、(図 1C) を観察することができます。必要な場合は、プレートを孵化させなさいまで 3 h するインキュベーターの湿度が十分に高く、滴がすぐに乾燥してください。このステップの間にドロップ量の減少が見られる場合は、湿度を高める井戸間のスペースに PBS を追加します。
   2. 非添付のセルを削除する 2 回培養液 1 mL と井戸を優しく洗います。各ウェルには、培地 1 mL を追加します。ない浮遊細胞が残る、そうでなければもう一度洗浄を倒立顕微鏡で確認します。一晩で、37 ° C、5% CO₂、加湿雰囲気、明確に定義された細胞シートを取得するセルを孵化させなさい。
      注: 浮遊細胞はプレートに再アタッチして不要な細胞群れ体を形成する可能性があります。

3. 刺激細胞 (3 日目)

1. 逆顕微鏡を使用してコロニーが正しく成長しているセルを確認するすべての井戸を確認します。必要に応じて、不適切な井戸をマークし、それらを使用しないでください。
2. 調査条件ごとに適切なプレートの各ウェルにラベルを付けます。重複した、または 3 通で各条件を実行します。
3. 0.1% 馬血清 (飢えた中) を含む DMEM/f12 キーでセルを餓死に媒体を変更 3 h 前に細胞が刺激されます。
4. EGF (最終濃度が 5 ng/mL) の添加、または他の目的の仲介によって細胞を刺激し、優しく 1 mL micropipettor を使用してメディアをミックス、プレートを旋回します。
5. セクション 4.1 で説明した刃先変位とのエッジの輪郭を観察する 1-4 日のプレートを孵化させなさいまたはセクション 4.2 で説明されているようにタイムラプス イメージングを実行します。

4. 細胞群れ体と細胞移動の可視化

1. ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色コロニー成長 (4-7 日目) を測定するには
   1. 70% エタノール (1 mL/ウェル) ~ 2 分のセルを修正します。
   2. ヘマトキシリン (1 mL/井戸)、~ 2 分で核を染色します。
   3. 洗浄細胞核まで水道水 (1 mL/も) が青、5-10 分。
   4. エオシン (1 mL/井戸)、~ 2 分で細胞質を染色します。
   5. (1 mL/井戸) の脱イオン水ですすいでください。
      注: ヘマトキシリンとエオシンのソリューションすることができます収集し、かすかな染色になるまで複数回使用します。
   6. プレートを風乾します。
   7. プレートを反転し、ドットの直径を定規で測定します。また、カメラ プレートの写真を撮るし、ImageJ でドットの直径を分析します。
2. 微速度顕微鏡観察 (日 3)
   1. インキュベータ顕微鏡に切り替えるし、37 ° c. に温度を調整DH₂5 %o. 調整 CO₂で加湿器を満たしなさい。インキュベーターのチャンバーを加湿して電動ステージを自由に移動できることを確認します。インキュベーターのチャンバーを閉じるでき、37 ° c. に調整する顕微鏡
      注: 顕微鏡を使用 (材料表参照) ここで、セルがフォーカスの漂流を避けるためにイメージを作成する前に、この少なくとも 3 h の 37 ° C まで加熱する必要があります。
   2. インキュベータ顕微鏡のステージにプレートを置き、ステージ リストを設定します。画像 2 つの反対端と各セル ドット (図 1A) の中心。
   3. 対物レンズ 10 倍を使用して 15-24 h の 3 分毎の画像を取る。データをダウンロードして、選択したプログラムで画像解析を続行などImageJ や Matlab。

結果

侵襲型を使用して (図 1) を紹介ドット アッセイを行った肺コロニー モデル システムとして乳癌細胞 (MCF10CA1a) を形成します。ドット アッセイを生成するのに便利ですし、初心者の手でも再現性の高いセル ドットと簡単な試金 (図 1D) を実行します。ドット アッセイは、HE 染色、またはタイムラプス イメージ?...

ディスカッション

腫瘍の進行の間に周囲の組織に侵入し、¹⁵遠隔部位に転移する起源の組織から移行します。細胞の細胞群からの移動は、ドットのアッセイで観察できます。ここでは、ドットの試金は EGF に応えてひと乳癌細胞の渡り鳥の表現型の分析によって例証されます。

ドットのセットアップでいくつかの手順の正確かつ複製可能な結果を得るための試金は重要で?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)