Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas

Resumen

Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.

Resumen

Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.

Introducción

Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona^1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un "cero" o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, permitiendo para el procesamiento de muestras múltiples. Sin embargo, mientras se hace la raya, las células se quitan físicamente de la monocapa y someterse a menudo a la muerte celular. Además, matriz extracelular, conectada a la placa a menudo se daña durante el proceso de raspado. Asimismo, el uso de silicona rellenos (tales como Ibidi cámaras⁴) o de plantillas de^5,6,7 puede conducir a la interrupción mecánica de las células y la eliminación parcial de las proteínas de la matriz utilizada para el recubrimiento de la placas. Otra desventaja de ensayos de control de cierre de las heridas o rasguños es su curso de tiempo limitado, como la migración de la célula sólo puede ser analizada hasta que se cierre el cero.

Al realizar el ensayo de punto, las células se platean como Colonia circular en una placa cubierta o sin recubrimiento⁸. La razón fundamental de esta estrategia de la galjanoplastia es obtener hojas de células con bordes definidos, que pueden migrar o invadir en los alrededores libres de células sin molestar a la cultura por la eliminación de las células o partes movibles. El objetivo general de la prueba de dot es observar la migración de hojas de celular medida por el desplazamiento del borde o diámetro de Colonia, así como para realizar Time-lapse de imágenes para analizar el fenotipo migratorio de las células en mayor resolución espacio-temporal.

Migración de la célula puede verse afectada por una variedad de señales microambiental como quimiocinas, citoquinas y factores de crecimiento como el EGF. EGF es un factor de crecimiento que ejerce sus efectos biológicos por Unión a su receptor, del receptor de EGF⁹y aumenta el comportamiento invasivo y metastásico de tumor las células^4,9,10. Aquí, el ensayo del punto se utiliza para el estudio de EGF estimula la migración de la célula en un humano invasor, pulmón formadoras mama cáncer célula línea (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocolo

1. capa de platos (día 1)

Nota: Asegúrese de no dejar huellas dactilares o suciedad en la parte inferior de la placa al manejarla.

1. Descongelar el colágeno de ratón IV en el hielo y diluir con 50 mM HCl (pH 1.3) para preparar 3 mL de solución 10 μg/mL colágeno IV.
   Nota: Colágeno precipitará a 37 ° C. Por lo tanto es importante mantener la solución de colágeno a baja temperatura descongelamiento y trabajando con él. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida mediante la preparación de alícuotas de tamaños adecuado y almacenamiento a-80 ° C.
2. Añadir solución de colágeno IV de 250 μl a cada pocillo de las placas de fondo de cristal 12-bien y colocarlos en una caja de plástico de tamaño adecuado, cierre firmemente. Coloque toalla de papel húmeda sobre y alrededor de las placas para la fabricación de una cámara húmeda y cerrar el cuadro. Incubar las placas durante la noche a temperatura ambiente.
   Nota: Como sólo el área de crecimiento necesita ser cubierto, es suficiente para cubrir solamente la hoja de cubierta, que se une a la parte inferior de la placa, con la solución de colágeno (ver figura 1A, B para un esquema de la placa).
3. A la mañana siguiente, enjuagar las placas con desionizada de H₂O dos veces para quitar el tampón y colágeno no absorbido. Dirigir el agua hasta el borde de la placa de la pozo, no hasta el borde formado por la placa inferior y el cubreobjetos (si agua se pipetea en esta área que salpicará). Deje secar al aire los platos en la campana de flujo laminar. Utilizar las placas inmediatamente o guardar a 4 ° C durante 5 días.
   Nota: Diferentes líneas celulares pueden requerir diferentes capa, como la fibronectina o colágeno I.

2. galjanoplastia el ensayo de punto (día 2)

1. Preparación de la suspensión de células
   1. Para preparar la suspensión celular, utilizar las células que se han cultivado en una placa de cultivo de tejido de 60 milímetros en medio DMEM/F12 suplementado con suero de caballo de 5% a 80% de confluencia
   2. Lavar las células con solución salina amortiguada de fosfatos de calcio y magnesio libres Dulbecco (DPBS) una vez, Añadir 500 μl de tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e Incube las células 3-5 minutos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO₂ambiente humidificado.
   3. Suspender las células separadas 4,5 mL medio de cultivo para parar la actividad de tripsina y contar 20 alícuota μl de la suspensión de células en un hemocitómetro.
   4. Sedimenten las células restantes en un tubo cónico de 15 mL por centrifugación a 200 x g durante 3 minutos, aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medio de cultivo a 3 x 10⁶ células/mL.
      Nota: Para otros sustratos de capa o líneas celulares, la densidad celular óptima debe establecerse en una serie de diluciones. 3 x 10⁶ células/mL se recomienda como punto de partida.
2. Las células de la galjanoplastia
   1. Lugar un descenso de 10 μl de la suspensión celular en el centro de cada tapa del colágeno IV 12-bien vidrio inferior Placa revestida sin tocar ni rayar el recubrimiento (figura 1A, B). Incube la placa durante 30 min a 37 ° C, atmósfera humidificada, para permitir que las células a conectar. Ver en un microscopio invertido que se unen las células.
      Nota: Esto puede ser ve mejor en el borde de la gota, donde puede observarse la formación de una monocapa (figura 1C). Si es necesario, Incube la placa hasta 3 h. Asegúrese de que la humedad en la incubadora es lo suficientemente alta como las gotas pueden secar rápidamente. Si se observa una reducción del volumen de gota durante este paso, añadir PBS a los espacios entre los pozos para aumentar la humedad.
   2. Lave suavemente los pocillos con 1 mL de medio de cultivo dos veces para eliminar las células no inscritos. Añadir 1 mL medio de cultivo a cada pocillo. Ver en un microscopio invertido que ningunas células flotantes mantienen, de lo contrario lavar los pozos otra vez. Incube las células durante la noche a 37 ° C, 5% CO₂, atmósfera humidificada, para obtener hojas de celda bien definida.
      Nota: Celdas de flotación están probable que vuelva a acoplar a la placa y formar colonias de células no deseadas.

3. estimulando a las células (día 3)

1. Compruebe todos los pozos utilizando un microscopio inverso para ese celular colonias han crecido adecuadamente. Si es necesario, marcar pozos inadecuados y no los utilice.
2. Etiqueta de cada pocillo de la placa adecuada para cada condición de investigado. Ejecute cada condición en duplicado o triplicado.
3. Cambiar el medio para matar de hambre las células en DMEM/F12 que contiene 0.1% de suero equino (medio muerto de hambre) 3 h antes de que las células son estimuladas.
4. Estimular las células por adición de EGF (concentración final de 5 ng/mL) o por otros mediadores deseadas y mezcle suavemente el medio utilizando una micropipeta de 1 mL o agitando la placa.
5. Incube la placa durante 1-4 días observar el desplazamiento de borde y contorno de borde tal como se describe en la sección 4.1 o realizar proyección de imagen de Time-lapse como se describe en la sección 4.2.

4. visualización de colonias de células y la migración celular

1. Hematoxilina-eosina (HE) tinción para medir el crecimiento de la Colonia (día 4-7)
   1. Fijar las células en etanol al 70% (1 mL/pocillo) durante 2 minutos.
   2. Tinción con hematoxilina (1 mL/pocillo), min ~ 2 núcleos.
   3. Células de lavado con agua del grifo (1 mL/pocillo) hasta los núcleos son de color azules, 5-10 minutos.
   4. Citoplasma de tinción con eosina (1 mL/pocillo), ~ 2 min.
   5. Enjuague con agua desionizada (1 mL/pocillo).
      Nota: Soluciones de hematoxilina y eosina pueden ser recogidas y utilizadas varias veces hasta que la coloración se convierte en débil.
   6. Placa de secado al aire.
   7. Dé vuelta la placa y medir el diámetro del punto con una regla. Alternativamente, tomar fotos de la placa con una cámara y analizar el punto de diámetro en ImageJ.
2. Time-lapse microscopia (día 3)
   1. Encienda el microscopio de la incubadora y ajustar la temperatura a 37 ° C. Llene el humidificador con dH₂O. ajustar el CO₂ al 5%. Asegúrese de que la cámara de la incubadora es humidificada y que la etapa motorizada puede moverse libremente. Cierre la cámara incubadora y permita que el microscopio a 37 ° C.
      Nota: El microscopio (véase la tabla de materiales) utilizado aquí se debe calentar a 37 ° C durante al menos 3 horas antes de que las células son imágenes para evitar la deriva de la atención.
   2. Coloque la placa en la etapa del microscopio incubadora y configurar la lista de la etapa. Imagen dos bordes opuestos y el centro de cada punto de la célula (figura 1A).
   3. Tomar imágenes cada 3 minutos, para 15-24 h con el objetivo de X 10. Descargar los datos y proceder a su análisis de la imagen en un programa de elección, por ejemplo, ImageJ o Matlab.

Resultados

El ensayo de punto presentado (figura 1) se realizó con invasor, Colonia de pulmón formando las células de cáncer de mama (MCF10CA1a) como modelo. El ensayo de punto cede puntos celular altamente reproducibles en manos de principiantes, lo que es un conveniente y fácil de ejecutar el ensayo (figura 1D). El ensayo de punto combinado con la coloración, o proyección de imagen de Time-lapse y partícula poster...

Discusión

En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes¹⁵. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.

Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)