用点法分析细胞板的迁移

摘要

细胞迁移是发展, 组织维护和修复, 和肿瘤发生的关键, 并由生长因子, 趋化因子, 和细胞因子调节。本协议描述的点法, 一个二维, 无约束的迁移分析, 以评估微提示的反应, 连接的, 有凝聚力的细胞表移表型。

摘要

虽然复杂的有机体出现静态, 他们的组织是在连续的营业额之下。随着细胞衰老, 死亡, 并被新的细胞取代, 细胞在组织内以一种严密的方式移动。在肿瘤的发展过程中, 这种平衡受到干扰, 肿瘤细胞离开原发细胞侵入局部微环境, 前往远处的地点, 最终形成远处的转移性肿瘤。点法是一个简单的, 二维无约束迁移分析, 以评估细胞板的净移动到一个无细胞的区域, 并利用时间推移成像的细胞迁移参数。在这里, 点化验显示使用一个人侵入, 肺殖民地形成乳腺癌细胞线, MCF10CA1a, 以分析细胞的迁移反应表皮生长因子 (EGF), 这是已知的增加恶性电位的乳腺癌细胞和改变细胞的迁移表型。

引言

迁移分析被广泛用于评价肿瘤细胞的侵袭和转移潜能体外。最常见的情况是, 伤口或划痕检测是用来评估上皮细胞的迁移到一个单元清除区域^1,2,3。为了进行划痕分析, 细胞被镀成单层, "划痕" 或无细胞区是用吸管尖端创建的。刮痕分析很容易建立与常用的组织培养用品, 可以进行多井板, 允许处理多个样品。然而, 当划痕时, 细胞从单层中被物理地移除, 并经常经历细胞死亡。此外, 在刮伤过程中, 细胞外基质常被破坏。同样, 使用硅刀片 (如信息处理室⁴) 或模具的^5、6、7可以导致细胞的机械破坏和用于涂层的基质蛋白的部分去除。板.检测伤口或划痕闭合的另一个缺点是其有限的时间过程, 因为只有在抓痕闭合时才能分析细胞迁移。

在进行点检测时, 细胞被镀成一个圆形的菌落到涂层或未涂覆的平板上⁸。这种电镀策略的基本原理是获得具有定义边缘的细胞板, 它可以迁移或侵入周围的无细胞区, 而不会通过去除细胞或插入物而扰乱培养。斑点法的总体目标是观察细胞板的迁移, 如边缘位移或菌落直径, 以及执行时间推移成像, 以分析更高的时空分辨率的细胞移行表型。

细胞迁移可能受到各种微的影响, 如趋化因子, 细胞因子, 和生长因子, 如 EGF。egf 是通过结合其受体、egf 受体⁹而施加其生物效应的生长因子, 并增加肿瘤细胞的侵袭和转移行为^4、9、10。在这里, 点法是用来研究 EGF 刺激细胞迁移在一个人侵入, 肺菌落形成乳腺癌细胞系 (MCF10CA1a)^8,11,12。

研究方案

1. 盘子的涂层 (1 天)

注意: 在处理时, 请务必不要将指纹或污垢留在盘子底部。

1. 解冻小鼠胶原 iv 在冰上, 和稀释它与50毫米 HCl (pH 1.3) 准备3毫升的10µg/毫升胶原蛋白 iv 溶液。
   注: 胶原蛋白在37° c 时会沉淀。因此, 保持胶原蛋白溶液在低温下融化并与之一起工作是很重要的。避免重复的冻融循环, 准备适当大小的等分和存储在-80 ° c。
2. 添加250µL 胶原 IV 溶液, 每井的12井玻璃底板, 并把它们放在一个适当大小, 紧合塑料盒。将湿纸巾放在盘子周围, 制造一个潮湿的房间并关上盒子。在室温下一夜之间孵育盘子。
   注: 由于只有生长区域需要涂敷, 所以只有覆盖的盖子滑动, 这是连接到板的底部, 与胶原蛋白溶液 (请参见图 1a, B的示意图板)。
3. 第二天早上, 冲洗盘子与去离子 H₂O 两次去除不吸收的胶原蛋白和缓冲。将水直接放到板的边缘, 而不是由板底和片形成的边缘 (如果水被 pipetted 到这个区域就会飞溅)。空气干燥板在层流罩。立即用盘子或在4° c 贮存5天。
   注: 不同的细胞系可能需要不同的涂层, 如纤维连接蛋白或胶原蛋白 i。

2. 电镀点检测 (2 天)

1. 准备细胞悬浮
   1. 要准备细胞悬浮, 使用在 DMEM/F12 培养基中生长的60毫米组织培养皿中的细胞, 辅以5% 匹马血清至80% 汇合
   2. 用钙和镁 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 冲洗细胞一次, 增加500µL 胰蛋白酶-EDTA (室温), 并孵育细胞为 3-5 分钟在一个孵化器在37° c, 5% CO₂, 湿润的气氛。
   3. 悬浮在4.5 毫升培养基中的分离细胞停止胰蛋白酶活性和计数20µL 分的细胞悬浮在例。
   4. 将剩余的细胞在15毫升锥形管中通过离心 200 x g 进行3分钟的颗粒, 吸取上清液, 并重培养基中的细胞到 3 x 10⁶细胞/毫升。
      注: 对于其他涂层基底和/或细胞系, 最佳的细胞密度必须建立在稀释系列。建议将 3 x 10⁶单元/mL 作为起始点。
2. 电镀电池
   1. 将10µL 的细胞悬浮液放在 IV 型胶原涂层12井玻璃底板的每个盖板的中心, 而不触及或刮伤涂层 (图 1a, B)。孵育板为30分钟, 在37° c, 湿润的气氛, 让细胞附着。在倒置显微镜中检查细胞的附着。
      注意: 这在下落的边缘可以是最好看见的, 在那里单层的形成可以被观察 (图 1C)。如有必要, 可将钢板孵育至 3 h. 确保孵化箱内的湿度足够高, 因为水滴可以快速干燥。如果在这一步的下降量减少观察, 增加 PBS 的空间之间的井, 以增加湿度。
   2. 用1毫升培养基轻轻冲洗两次, 去除非附着细胞。每井添加1毫升培养基。检查一个倒置的显微镜, 没有漂浮的细胞保持, 否则洗井再次。在37° c 的夜间孵育细胞, 5% CO₂, 湿润的气氛, 获得良好定义的细胞表。
      注: 漂浮细胞很可能会重新附着在盘子上, 形成不受欢迎的细胞群。

3. 刺激细胞 (3 天)

1. 使用反显微镜检查所有水井, 确保细胞菌落生长正常。如有必要, 标记不合适的水井, 不要使用。
2. 为所调查的每个条件适当地标记每一个板块。每一个条件运行一式两份或一式三份。
3. 改变培养基, 使其在细胞被刺激之前, 在含有0.1% 马血清 (饥饿培养基) 的 DMEM/F12 3 小时内使细胞挨饿。
4. 通过添加 EGF (5 ng/毫升最终浓度) 或其他所需的介质来刺激细胞, 用1毫升的 micropipettor 或旋转盘子轻轻地混合培养基。
5. 孵育该板块 1-4 天, 以观察边缘位移和边缘轮廓, 如第4.1 节所述, 或执行时间推移成像, 如在4.2 节所述。

4. 细胞菌落和细胞迁移的可视化

1. 苏木精-曙红 (he) 染色测量菌落生长 (日 4-7)
   1. 将70% 乙醇 (1 毫升/井) 的细胞固定在2分钟。
   2. 染色核与苏木精 (1 毫升/井), 〜2分钟。
   3. 用自来水冲洗细胞 (1 毫升/井) 直到细胞核是蓝色的, 5-10 分钟。
   4. 染色细胞质与曙红 (1 毫升/井), 〜2分钟。
   5. 用去离子水冲洗 (1 毫升/井)。
      注意: 苏木精和红素溶液可以收集和使用多次, 直到染色变得微弱。
   6. 空气干燥板。
   7. 翻转板, 用尺子测量圆点的直径。或者, 用相机拍摄底片, 并分析 ImageJ 中的圆点直径。
2. 延时显微镜 (3 天)
   1. 打开孵化器显微镜, 将温度调整到37° c。用 dH 填充加湿器₂o 将 CO₂调整为5%。确保孵化室的湿化和机动阶段可以自由移动。关闭孵化室, 并允许显微镜调整到37° c。
      注: 在这里使用的显微镜 (见材料表) 应加热到37° c, 至少3小时, 然后细胞被成像, 以避免漂移的焦点。
   2. 把盘子放在孵化器显微镜的舞台上, 并设置舞台列表。图像两个对立的边缘和每个单元格点的中心 (图 1A)。
   3. 使用10X 目标, 每3分钟拍摄一次图像, 15-24 小时。下载数据并在选择的程序中进行图像分析,例如、ImageJ 或 Matlab。

结果

这里提出的点检测 (图 1) 是利用侵入性, 肺菌落形成乳腺癌细胞 (MCF10CA1a) 作为一个模型系统进行的。点检测产生高度可重现的细胞点, 甚至在初学者的手, 使其方便, 易于执行的检测 (图 1D)。斑点分析结合 he 染色, 或时间推移成像和后续粒子图像测速 (PIV), 允许研究各种迁移参数, 包括上皮边缘的位移, 细胞速度和细?...

讨论

在肿瘤进展过程中, 细胞从原发组织迁移到周围组织, 转移到远处的部位¹⁵。细胞群的迁移可以在点检测中观察到。在这里, 通过分析人乳腺癌细胞在 EGF 中的迁移表型来说明点测定。

为了获得准确和可复制的结果, 在点分析的设定中的几个步骤是至关重要的。首先, 板的涂层决定是否和如何强细胞能坚持板和如果细胞迁移。应注意的是, 该板的涂层与胶原 IV 或...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)