Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Resumo

Migração celular é essencial para o desenvolvimento, manutenção de tecidos e reparação e tumorigênese e é regulada por citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento. Este protocolo descreve o ensaio de ponto, um ensaio de migração bidimensional, irrestrita para avaliar o fenótipo migratório de folhas de célula unida, coesa, em resposta a sinais microenvironmental.

Resumo

Apesar de organismos complexos aparecem estáticos, seus tecidos estão sob contínua um volume de negócios. Como células de idade morrem e são substituídas por novas células, as células mover dentro de tecidos de forma bem orquestrada. Durante o desenvolvimento do tumor, este equilíbrio é perturbado, e células tumorais deixar o epitélio de origem para invadir o local microambiente, para viajar para locais distantes e, finalmente, formar tumores metastáticos em locais distantes. O ensaio de ponto é um ensaio de migração irrestrita simples, bidimensional, para avaliar o movimento líquido de folhas de célula em uma área livre de célula e analisar parâmetros de migração celular utilizando imagens de lapso de tempo. Aqui, o ensaio de ponto é demonstrado usando um humano invasivo, formadoras de pulmão em linhagem de células de câncer de mama, MCF10CA1a, para analisar a resposta de migratória das células para fator de crescimento epidérmico (EGF), que é conhecida por aumentar o potencial maligno das células de câncer de mama e para alterar o fenótipo migratório das células.

Introdução

Ensaios de migração são amplamente utilizados para avaliar o potencial invasivo e metastático do tumor células em vitro. Mais comumente, a ferida ou ensaio zero é usado para avaliar a migração de folhas epiteliais em uma célula desmarcada área^1,2,3. Para realizar o ensaio de zero, as células são banhadas em um monolayer e uma área livre de célula ou "zero" é criada com uma ponta da pipeta. O ensaio de zero é fácil de configurar com suprimentos de cultura de tecidos comumente disponíveis e pode ser executado em placas multi bem, permitindo processamento de amostras múltiplas. No entanto, como é feito o zero, células são fisicamente removidas a monocamada e muitas vezes passam por morte celular. Além disso, ligada à placa de matriz extracelular é muitas vezes danificada durante o processo de coçar. Da mesma forma, o uso de silício insere (tais como câmaras de Ibidi⁴) ou de estênceis^5,6,7 pode levar a ruptura mecânica das células e a remoção parcial de proteínas da matriz usada para revestimento a placas. Outra desvantagem dos ensaios de acompanhamento de fechamento de ferimentos ou arranhões é seu curso de tempo limitado, como migração celular só pode ser analisada até que o zero é fechado.

Realizar o ensaio de ponto, as células são banhadas como uma colônia circular sobre uma placa revestidos ou não revestidos de⁸. A justificativa para esta estratégia de chapeamento é obter lençóis de células com bordas definidas, que podem migrar ou invadir em áreas circundantes sem célula sem perturbar a cultura pela remoção de células ou inserções. O objetivo geral do ensaio ponto é observar a migração das folhas de célula medida pelo deslocamento de borda ou diâmetro colônia, bem como para realizar a imagem de lapso de tempo para analisar o fenótipo migratório das células em maior resolução espaço-temporal.

Migração celular pode ser afetada por uma variedade de sugestões microenvironmental como fatores de crescimento como EGF, citocinas e quimiocinas. EGF é um fator de crescimento que exerce seus efeitos biológicos através da ligação ao seu receptor, o receptor de EGF⁹e aumenta o comportamento invasivo e metastático de células de tumor a^4,9,10. Aqui, o ensaio de ponto é usado para estudar EGF estimulou a migração de células em uma colônia de pulmão humano invasoras, formando mama câncer célula linha (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocolo

1. revestimento de pratos (dia 1)

Nota: Certifique-se para não deixar impressões digitais ou sujeira na parte inferior da placa, quando manuseá-lo.

1. Descongelar o colágeno rato IV no gelo e dilui-lo com 50mm HCl (pH 1,3) para preparar 3 mL de solução 10 µ g/mL colagénio IV.
   Nota: Colágeno irá precipitar a 37 ° C. Portanto, é importante manter a solução de colágeno em uma baixa temperatura ao descongelamento e trabalhar com ele. Evite ciclos repetidos de congelamento-descongelamento por preparar alíquotas de tamanhos adequado e armazená-los a-80 ° C.
2. Adicionar solução de colágeno IV 250 µ l de cada poço de placas de vidro 12-poço fundo e colocá-los em uma caixa plástica de tamanho adequado, apertado-fechamento. Coloque a toalha de papel molhada sobre e ao redor as placas para fabricar uma câmara húmida e fechar a caixa. Incube as placas durante a noite em temperatura ambiente.
   Nota: Como somente a área de crescimento precisa ser revestida, é suficiente para cobrir apenas o deslizamento da tampa, que é anexado à parte inferior da placa, com solução de colágeno (consulte a Figura 1A, B para um esquema da placa).
3. Na manhã seguinte, lave as placas com desionizada H₂O duas vezes para remover o tampão e colágeno não-absorvido. Direcionar a água até a borda da placa bem, não à borda formada pela placa inferior e a lamela (se a água é pipetada para esta área que vai espirrar). Secar ao ar livre as placas do capuz de fluxo laminar. Usar placas imediatamente ou armazenar a 4 ° C por até 5 dias.
   Nota: Linhas celulares diferentes podem exigir diferentes do revestimento, como fibronectina ou colágeno eu.

2. chapeamento do ponto do ensaio (dia 2)

1. Preparar a suspensão de células
   1. Para preparar a suspensão de células, use as células que têm sido cultivadas em um prato de cultura de tecido-60mm em DMEM/F12 suplementado com 5% de soro de cavalo a confluência de 80%
   2. Enxagúe as células com solução salina tamponada fosfato de cálcio e magnésio livre Dulbecco (DPBS) uma vez, adicionar 500 µ l do trypsin-EDTA (temperatura ambiente) e incube as celulas por 3-5 min em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO₂, ambiente umidificado.
   3. Suspender as células destacadas em 4,5 mL de meio de cultura para parar a atividade de tripsina e contar 20 alíquota µ l de suspensão de células em um hemocytometer.
   4. As células restantes em um tubo cônico de 15 mL de pelotas por centrifugação a 200 x g, durante 3 min, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura para 3 x 10⁶ células/mL.
      Nota: Para outros substratos de revestimento e/ou linhas de células, a densidade celular ideal deve ser estabelecida em uma série de diluição. 3 x 10⁶ células/mL recomenda-se como ponto de partida.
2. Células de chapeamento
   1. Lugar uma gota de 10 µ l de suspensão de células no centro de cada lamela do colagénio IV revestido a placa de vidro 12-poço fundo sem tocar ou coçar o revestimento (Figura 1A, B). Incube a placa por 30 min a 37 ° C, ambiente umidificado, para permitir que as células anexar. Verifique em um microscópio invertido as células estão presas.
      Nota: Isto pode ser melhor visto na borda da gota, onde a formação de uma monocamada pode ser observada (Figura 1C). Se necessário, incubar a placa até 3 h. Certifique-se de que a umidade na incubadora é alta o suficiente, como as gotas podem secar rapidamente. Se for observada uma redução do volume gota durante esta etapa, adicione PBS para os espaços entre os poços para aumentar a umidade.
   2. Delicadamente lave os poços com 1 mL de meio de cultura duas vezes para remover as células não-inscritos. Adicione 1 mL de meio de cultura para cada poço. Check-in um microscópio invertido que nenhuma célula flutuante permanecem, caso contrário, lavar os poços novamente. Incube as células durante a noite a 37 ° C, 5% de CO₂, ambiente umidificado, para obter folhas de celular bem definida.
      Nota: Células flutuante são prováveis para re-anexar à placa e formam colônias de células indesejáveis.

3. estimular células (dia 3)

1. Verifique se todos os poços, usando um microscópio inverso para garantir essa célula colônias cresceram adequadamente. Se necessário, marque poços inadequados e não usá-los.
2. Etiquete cada poço da placa apropriadamente para cada condição de investigado. Execute cada condição em duplicado ou triplicado.
3. Mudar o meio para morrer de fome as células em DMEM/F12 contendo 0,1% de soro de cavalo (meio faminto) 3 h antes que as células são estimuladas.
4. Estimular as células pela adição de EGF (concentração final de 5 ng/mL) ou outros mediadores desejados e misture suavemente o meio utilizando um micropepitador de 1 mL ou agitando a placa.
5. Incubar a placa por 1-4 dias para observar o deslocamento de borda e contorno de borda conforme descrito na seção 4.1 ou executar a imagem latente de lapso de tempo, conforme descrito na seção 4.2.

4. visualização de colônias de células e migração celular

1. Hematoxilina-eosina (HE) coloração para medir o crescimento da colônia (dia 4-7)
   1. Conserte as células em etanol a 70% (1 mL/poço) para ~ 2 min.
   2. Mancha de núcleos com hematoxilina (1 mL/poço), ~ 2 min.
   3. Células de lavagem com água da torneira (1 mL/poço) até núcleos são azuis, 5-10 min.
   4. Mancha de citoplasma com eosina (1 mL/poço), ~ 2 min.
   5. Enxague com água desionizada (1 mL/poço).
      Nota: Soluções de hematoxilina e eosina podem ser coletadas e usadas várias vezes até que a mancha se torna fraco.
   6. Secar a placa.
   7. Inverter a placa e medir o diâmetro do ponto com uma régua. Alternativamente, tirar fotos da placa com uma câmera e analisar o diâmetro do ponto no ImageJ.
2. Microscopia de lapso de tempo (dia 3)
   1. Ligar o microscópio de incubadora e ajustar a temperatura de 37 ° C. Encha o umidificador com dH₂O. ajustar o CO₂ a 5%. Certifique-se que a câmara incubadora é úmida e que o palco motorizado pode mover-se livremente. Fechar a câmara incubadora e permitir que o microscópio ajustar a 37 ° C.
      Nota: O microscópio (consulte a tabela de materiais) usado aqui deve ser aquecido a 37 ° C, durante pelo menos 3 h antes que as células são fotografadas para evitar deriva do foco.
   2. Colocar a placa no palco do microscópio incubadora e configurar a lista de palco. Duas arestas opostas de imagem e o centro de cada ponto de célula (Figura 1A).
   3. Com imagens a cada 3 min, de 15-24 h, com o objetivo de X 10. Baixar os dados e prosseguir com a análise de imagem em um programa de escolha, por exemplo, ImageJ ou Matlab.

Resultados

O ensaio de ponto aqui apresentado (Figura 1) foi realizado utilizando invasiva, colônia de pulmão formando células de câncer de mama (MCF10CA1a) como um sistema modelo. O ensaio de ponto rende pontos de célula altamente reprodutível nem na mão de iniciantes, tornando-se um conveniente e fácil de executar o ensaio (Figura 1D). O ensaio de ponto combinado com ele mancha, ou lapso de tempo de imagem e subse...

Discussão

Durante as células de progressão do tumor migre longe do tecido de origem para invadir o tecido circundante e metástase para locais distantes¹⁵. Migração de células de uma colônia de células pode ser observada no ensaio de ponto. Aqui, o ensaio de ponto é ilustrado por analisar o fenótipo migratório de células de câncer de mama humano em resposta a EGF.

Para obter resultados precisos e replicáveis várias etapas na configuração do ponto os ensaios são c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)