באמצעות וזמינותו נקודה כדי לנתח את ההעברה של גיליונות תא

Summary

נדידת תאים הוא חיוני עבור פיתוח, רקמות תחזוקה ותיקון, ו tumorigenesis, מוסדר על ידי גורמי גדילה, נוגדנים, ציטוקינים. פרוטוקול זה מתאר נקודה וזמינותו, העברה דו מימדי, ולמשחקי הנועד להעריך את פנוטיפ הנדידה של גיליונות המצורפת, מלוכדת תא בתגובה רמזים microenvironmental.

Abstract

אף אורגניזם מורכב מופיעות סטטי, הרקמות שלהם נמצאים תחת מחזור רציף. כמו תאים גיל, למות, והם יוחלפו על ידי תאים חדשים, תאים להעביר בתוך רקמות באופן הדוק מתוזמר. במהלך התפתחות גידולים, את האיזון מופר, ולהשאיר תאים סרטניים האפיתל ממוצא לפלוש את microenvironment המקומי, כדי לנסוע לאתרים מרוחקים, ובסופו של דבר להקים גידולים גרורות באתרים מרוחקים. וזמינותו נקודה היא assay פשוטה, מימדי ההעברה ללא הגבלה, כדי להעריך את התנועה נטו של גיליונות תא לתוך אזור ללא תא, וכדי לנתח את הפרמטרים של נדידת תאים באמצעות הדמיה בצילום מואץ. . הנה, וזמינותו נקודה הוכח שימוש של האדם פולשני, ריאות המושבה ויוצרים השד סרטן תאים בטור, MCF10CA1a, כדי לנתח בתגובה הנדידה התאים גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), אשר ידוע כדי להגדיל את פוטנציאל ממאיר של תאים סרטניים בשד, כדי לשנות את פנוטיפ הנדידה של תאים.

Introduction

העברת מבחני נמצאים בשימוש נרחב כדי להעריך את הפוטנציאל פולשני ולא גרורתי של גידול תאים במבחנה. הנפוץ ביותר הפצע או גירוד assay משמש כדי להעריך את ההעברה של אפיתל גיליונות^2,31,אזור תא מסומנת. כדי לבצע את הבדיקה מאפס, התאים הם מצופים לתוך טפט, "שריטה" או מאזור תא נוצר עם טיפ פיפטה. וזמינותו גירוד קל להגדיר עם תרביות רקמה זמין נפוץ אספקה, ניתן לבצע גם צלחות רב טוב, ומאפשרת עיבוד של דגימות מרובים. עם זאת, כפי השריטה נעשית, התאים יוסרו פיזית טפט, לעיתים קרובות עוברים מוות של תאים. יתר על כן, מטריצה חוץ-תאית מחובר לצלחת פגום לעיתים קרובות במהלך התהליך של גירוד. בדומה לכך, השימוש של סיליקון מוסיף (כגון Ibidi צ'יימברס⁴) או של סטנסילים^5,6,7 יכול להוביל להפרעה מכנית של התאים הסרת חלקי של מטריקס חלבון ציפוי צלחות. חיסרון נוסף של מבחני פיקוח על סגירתו של פצעים או שריטות הוא קורס שלהם לזמן מוגבל, רק יכול להיות מנותח נדידת תאים עד השריטה סגורה.

ביצוע וזמינותו נקודה, התאים הם מצופה כמושבה מעגלית על גבי צלחת עם או בלי ציפוי⁸. הרציונל שאסטרטגיה זו ציפוי הוא לקבל תא סדינים עם קצוות מוגדרים, שניתן להעביר או לפלוש לתוך האזורים הסמוכים נטול תאים מבלי להפריע את התרבות על ידי הסרה של תאים או מוסיף. המטרה הכוללת של וזמינותו נקודה היא לבחון את ההעברה של גיליונות תא כפי שנמדד על-ידי קצה העקירה או מושבת קוטר, כמו גם כדי לבצע הדמיה בצילום מואץ כדי לנתח את פנוטיפ הנדידה של תאים בעתיים רזולוציה גבוהה יותר.

נדידת תאים יכולים להיות מושפעים מגוון של רמזים microenvironmental כמו נוגדנים, ציטוקינים גורמי גדילה כגון EGF. EGF הוא פקטור גדילה זה מפעיל את השפעותיו ביולוגי באמצעות קשירה לקולטן שלו, EGF קולטן⁹, ומגביר את התנהגות פולשנית ולא גרורתי של גידול תאים^4,9,10. כאן, וזמינותו נקודה משמש ללמוד EGF מגורה נדידת תאים במושבה האנושי פולשני, ריאות ויוצרים השד סרטן תא קו (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocol

1. ציפוי של מנות (יום 1)

הערה: הקפד לא להשאיר טביעות אצבעות או לכלוך בתחתית הצלחת בעת טיפול זה.

1. הפשרת העכבר קולגן הרביעי על קרח, לדלל את זה עם 50 מ"מ HCl (pH 1.3) להכין 3 מ"ל של פתרון הרביעי 10 µg/mL קולגן.
   הערה: קולגן לזרז ב 37 º C. לכן חשוב לשמור את הפתרון קולגן בטמפרטורה נמוכה בעת מפשיר ובעבודה עם זה. להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה על-ידי הכנת aliquots בגודל מתאים ואחסונם ב-80 מעלות צלזיוס.
2. להוסיף 250 פתרון קולגן הרביעי µL כל טוב של לוחות זכוכית 12-ובכן, למקם אותם לתוך קופסת פלסטיק בגודל מתאים, סגירה הדוקה. מניחים מגבת נייר רטובה מעל ומסביב הלוחות מייצרים תא לח ולסגור את תיבת. דגירה הלוחות ללילה בטמפרטורת החדר.
   הערה: כפי רק את אזור הגידול צריך להיות מצופה, זה מספיק לכסות רק על הרכב כיסוי, אשר מצורף בתחתית הלוח, עם פתרון קולגן (ראה איור 1A, B עבור סכימטי של צלחת).
3. למחרת בבוקר לשטוף צלחות עם יונים H₂O פעמיים כדי להסיר קולגן שאינו נספג ומאגר. לכוון את המים עד לקצה הלוח לא עד הקצה שהוקמה על ידי בתחתית צלחת של coverslip (אם מים זה pipetted לתוך האיזור שזה ישחה). מילה נהדרת הלוחות בשכונה זרימה שכבתית. השתמש צלחות מיד או לאחסן ב 4 ° C עד 5 ימים.
   הערה: שורות תאים שונים עשויים לדרוש שונים ציפוי, כגון fibronectin או קולגן אני.

2. ציפוי וזמינותו נקודה (יום 2)

1. הכנת התליה תא
   1. כדי להכין תא ההשעיה, להשתמש בתאים כך כבר גדלו בקערה תרביות רקמה 60 מ מ בינוני DMEM/F12 בתוספת 5% סרום סוס כדי 80% הנהרות
   2. לשטוף את התאים בתמיסת פוספט באגירה של סידן, מגנזיום-ללא Dulbecco (DPBS) פעם אחת, להוסיף µL 500 טריפסין-EDTA (בטמפרטורת החדר), דגירה התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור 37 ° C, 5% CO₂, אווירה humidified.
   3. להשעות את התאים מנותקת במדיום תרבות 4.5 מ ל להפסיק פעילות טריפסין, נחשב 20 µL aliquot של התליה תא ב hemocytometer.
   4. גלולה התאים הנותרים צינור חרוטי 15 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב g x 200 למשך 3 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים תרבות בינוני 3 x 10⁶ תאים/מ ל....
      הערה: עבור אחרים ציפוי דיאלקטריים ו/או שורות תאים, צפיפות תא אופטימלי יש ליצור בסדרה דילול. 3 x 10⁶ תאים למ"ל מומלצת כנקודת התחלה.
2. תאי ציפוי
   1. המקום טיפת 10 µL תא ההשעיה במרכזו של כל תלוש הכיסוי של הקולגן הרביעי מצופה צלחת זכוכית 12-ובכן התחתון בלי לגעת או לשרוט את הציפוי (איור 1א', ב'). דגירה את הצלחת למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס, האווירה humidified, כדי לאפשר את התאים לצרף. צ'ק במיקרוסקופ הפוך התאים מחוברים.
      הערה: ניתן בצורה הטובה ביותר לראות בקצה הירידה, איפה היווצרות טפט יכול להיות שנצפו (איור 1C). במידת הצורך, דגירה את הצלחת עד ה 3 להיות בטוח כי הלחות בחממה הוא מספיק גבוה כפי הטיפות יכול להתייבש במהירות. אם נצפית ירידה של אמצעי האחסון טיפה במהלך שלב זה, להוסיף החללים בין הבארות כדי להגדיל את הלחות PBS.
   2. יש לשטוף בעדינות הבארות עם 1 מ"ל של תרבות בינוני פעמיים כדי להסיר תאים שאינם מצורפים. להוסיף 1 מ"ל תרבות בינוני כל טוב. צ'ק במיקרוסקופ הפוך כי לא התאים צפים נשארים, אחרת לשטוף שוב את הבארות. דגירה תאים בין לילה-37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, האווירה humidified, כדי לקבל גיליונות תא מוגדרים היטב.
      הערה: תאים צף סביר כדי לצרף מחדש הצלחת ואת להקים מושבות תאים לא רצויים.

3. גירוי תאים (יום 3)

1. בדוק כל הבארות באמצעות מיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שתא מושבות גדלו כראוי. במידת הצורך, מארק בארות ומבניות, אל תשתמש בהם.
2. תווית מכל קידוח של צלחת הולם עבור כל תנאי חקר. הפעל כל תנאי כפול או משולש.
3. לשנות את המדיום לרעוב התאים DMEM/F12 המכיל סרום הסוס 0.1% (רעב בינוני) h 3 לפני התאים הם גירוי.
4. לגרות את התאים על ידי תוספת של EGF (ריכוז סופי 5 ng/mL) או עוד מגשרים הרצוי ומערבבים בעדינות את המדיום באמצעות micropipettor 1 מ"ל או על-ידי מתערבל לצלחת.
5. דגירה שלוחית 1-4 ימים לבחון את קצה הזחה וירידה קצה מתאר כמתואר בסעיף 4.1 או לבצע הדמיה בצילום מואץ כמתואר בסעיף 4.2.

4. ויזואליזציה של מושבות תאים, נדידת תאים

1. Hematoxylin-אאוזין (הוא) צביעת למדידת צמיחה המושבה (היום 4-7)
   1. לתקן תאים ב- 70% אתנול (1 מ"ל/טוב) ~ 2 דקות.
   2. כתם גרעינים עם hematoxylin (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
   3. תאים תשטוף עם מים מהברז (1 מ"ל/טוב) עד הגרעינים הם כחול, 5-10 דקות.
   4. הציטופלסמה הכתם עם אאוזין (1 מ"ל/טוב), ~ 2 דקות.
   5. לשטוף עם מים יונים (1 מ"ל/טוב).
      הערה: Hematoxylin ופתרונות אאוזין יכול להיות ונשתמש בהם מספר פעמים עד ההכתמה הופך להיות חלש.
   6. מילה נהדרת צלחת.
   7. הפוך את הצלחת ולמדוד את הקוטר נקודה עם סרגל. לחלופין, לצלם תמונות של הצלחת עם מצלמה, ולנתח נקודה בקוטר של ImageJ.
2. זמן לשגות מיקרוסקופ (3 ביום)
   1. . הפעילי את המיקרוסקופ חממה ולהתאים את הטמפרטורה ל- 37 מעלות צלזיוס. למלא מעשיר dH₂O. התאם CO₂ ל 5%. ודא כי תא חממה הוא humidified כי השלב ממונע יכול לנוע בחופשיות. לסגור את תא חממה ולאפשר המיקרוסקופ להסתגל 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: המיקרוסקופ (ראה טבלה של החומרים) להשתמש כאן צריך להיות מחומם עד 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות לפני התאים הם צילמו כדי למנוע היסחפות של המוקד.
   2. למקם את הצלחת על השלב של המיקרוסקופ חממה והגדר את הרשימה הבמה. תמונת שני קצוות מנוגדים, המרכז של כל נקודה תא (איור 1א').
   3. קח תמונות כל 3 דקות, עבור h 15-24 באמצעות המטרה X 10. להוריד את הנתונים ולהמשיך עם ניתוח תמונות בתוכנית של בחירה, למשל, ImageJ או Matlab.

תוצאות

וזמינותו נקודה המובאת כאן (איור 1) בוצעה באמצעות פולשני, ריאות המושבה ויוצרים תאים סרטניים בשד (MCF10CA1a) כמערכת מודל. וזמינותו נקודה התשואות תא מאוד לשחזור נקודות אפילו בידו של מתחילים נוחה וקלה לביצוע assay (איור 1D). וזמינותו נקודה בשי?...

Discussion

במהלך הגידול התקדמות התאים נודדים מן הרקמה ממוצא לפלוש הרקמה שמסביב, גרורות באתרים מרוחקים¹⁵. נדידה של תאים מן מושבה התא יכול להיות שנצפו ב- dot וזמינותו. . הנה, וזמינותו נקודה מודגם על ידי ניתוח של פנוטיפ הנדידה של תאי סרטן השד אנושי בתגובה EGF.

כדי להשיג תוצאות מדוי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)