Usando l'analisi di Dot per analizzare la migrazione degli strati delle cellule

Riepilogo

Migrazione delle cellule è essenziale per lo sviluppo, manutenzione dei tessuti e riparazione e tumorigenesi ed è regolata da fattori di crescita, chemochine e citochine. Questo protocollo descrive il dosaggio di dot, un'analisi bidimensionale, senza vincoli di migrazione per valutare il fenotipo migratore di strati delle cellule allegata, coesa in risposta a stimoli microambientali.

Abstract

Anche se gli organismi complessi appaiono statici, i loro tessuti sono sotto un continuo turnover. Come cellule età, muoiono e sono sostituite da nuove cellule, cellule spostano all'interno dei tessuti in maniera ben orchestrata. Durante lo sviluppo del tumore, questo equilibrio è disturbato, e lasciano le cellule del tumore dell'epitelio di origine per invadere il microambiente locale, viaggiare in luoghi distanti e in definitiva formare tumori metastatici ai luoghi distanti. Il metodo di dot è un semplice, bidimensionale migrazione senza vincoli, per valutare il movimento netto di strati delle cellule in una zona senza cellula e per analizzare i parametri della migrazione cellulare usando la formazione immagine di time-lapse. Qui, il dosaggio di dot è dimostrato utilizzando un umani dilaganti, la linea cellulare del cancro al seno, MCF10CA1a, di formazione di colonie di polmone per analizzare la risposta migratoria delle cellule di fattore di crescita epidermico (EGF), che è noto per aumentare il potenziale maligno delle cellule di cancro al seno e per modificare il fenotipo migratorio delle cellule.

Introduzione

Saggi di migrazione sono ampiamente utilizzati per valutare il potenziale invasivo e metastatico delle cellule del tumore in vitro. Più comunemente, la ferita o dosaggio zero viene utilizzato per valutare la migrazione epiteliale fogli in una cella deselezionata zona^1,2,3. Per eseguire l'analisi di gratta e Vinci, le cellule sono placcate in un monostrato e un "graffio" o zona senza cellula viene creato con un puntale. Il dosaggio zero è facile da configurare con i rifornimenti di coltura del tessuto comunemente disponibili e possa essere eseguito in piastre multi-pozzetto, permettendo per la lavorazione dei campioni multipli. Tuttavia, come è fatto il graffio, cellule sono fisicamente da strato monomolecolare e spesso subiscono la morte delle cellule. Inoltre, fissato alla piastra di tabella extracellulare è spesso danneggiata durante il processo di graffio. Allo stesso modo, l'uso di silicone inserti (ad esempio Ibidi chambers⁴) o degli stampini^5,6,7 può portare alla rottura meccanica delle cellule e la parziale rimozione delle proteine della matrice utilizzato per il rivestimento del piatti. Un altro svantaggio delle analisi monitoraggio della chiusura delle ferite o graffi è loro corso di tempo limitato, come la migrazione delle cellule può essere analizzata solo fino a quando il graffio è chiuso.

Nell'esecuzione del saggio di dot, le cellule sono placcate come Colonia circolare su una piastra con o senza rivestimento⁸. La spiegazione razionale per questa strategia di placcatura è di ottenere strati delle cellule con bordi definiti, che possono migrare o invadere nelle zone circostanti senza cellula senza disturbare la cultura tramite rimozione di cellule o inserti. L'obiettivo generale del dosaggio dot è di osservare la migrazione degli strati delle cellule misurata dal bordo spostamento o diametro di Colonia, nonché eseguire imaging time-lapse per analizzare il fenotipo migratorio delle cellule in alta risoluzione spazio-temporale.

Migrazione delle cellule può essere influenzata da una varietà di stimoli microambientali come chemochine, citochine e fattori di crescita come EGF. L'EGF è un fattore di crescita che esercita i suoi effetti biologici attraverso il legame al suo recettore, il recettore di EGF⁹e aumenta il comportamento invasivo e metastatico del tumore le cellule^4,9,10. Qui, il dosaggio di dot è usato per studiare EGF stimolata migrazione cellulare in una colonia umana di polmone per il dilagante, formando al seno cancro cella linea (MCF10CA1a)^8,11,12.

Protocollo

1. rivestimento di piatti (giorno 1)

Nota: Assicurarsi di non lasciare impronte digitali o sporcizia sul fondo della piastra nel maneggiarlo.

1. Scongelare il collagene del mouse IV sul ghiaccio e diluirlo con 50mm HCl (pH 1.3) per preparare 3 mL di 10 µ g/mL collagene IV soluzione.
   Nota: Collagene precipiterà a 37 ° C. Pertanto è importante mantenere la soluzione di collagene a bassa temperatura durante lo scongelamento e lavorare con esso. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento di preparare aliquote di dimensioni appropriate e la loro conservazione a-80 ° C.
2. Aggiungere 250 µ l di soluzione di collagene IV ad ogni pozzetto 12-pozzetti inferiore delle lastre di vetro e metterli in una scatola di plastica di dimensione appropriate, chiusura ermetica. Posizionare il tovagliolo di carta bagnato sopra e intorno ai piatti del produrre una camera umida e chiudere la finestra. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente.
   Nota: Come solo l'area di crescita deve essere rivestito, è sufficiente coprire solo il coprioggetto, che è attaccato al fondo della piastra, con soluzione di collagene (Vedi Figura 1A, B per una schematica della piastra).
3. Mattina successiva, sciacquare piastre con deionizzata di H₂O due volte per rimuovere il tampone e collagene non assorbito. Dirigere l'acqua verso il bordo della piastra ben, non al bordo formato sul fondo del piatto e il vetrino coprioggetti (se acqua è pipettato in questa zona che esso verrà spruzzata). Asciugare le piastre nella cappa a flusso laminare. Utilizzare piastre immediatamente o conservare a 4 ° C fino a 5 giorni.
   Nota: Diverse linee cellulari potrebbero richiedere diversi rivestimento, quali fibronectina o collagene I.

2. placcatura del dosaggio di Dot (giorno 2)

1. Preparare la sospensione cellulare
   1. Per preparare la sospensione cellulare, utilizzare le cellule che sono state coltivate in un piatto di coltura del tessuto-60mm in DMEM/F12 supplementato con 5% di siero equino alla confluenza di 80%
   2. Sciacquare le cellule con la soluzione salina tamponata con fosfato di calcio e magnesio-free Dulbecco (DPBS) una volta, aggiungere 500 µ l tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e incubare le cellule per 3-5 min in un incubatore a 37 ° C, 5% CO₂, atmosfera umidificata.
   3. Sospendere le cellule indipendente in 4,5 mL di coltura per arrestare l'attività della tripsina e contare 20 aliquota µ l della sospensione delle cellule in un emocitometro.
   4. Appallottolare le celle rimanenti in una provetta conica da 15 mL mediante centrifugazione a 200 x g per 3 min, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in coltura per 3 x 10⁶ cellule/mL.
      Nota: Per altri substrati di rivestimento e/o linee cellulari, la densità cellulare ottimale deve essere stabilita in una serie di diluizioni. 3 x 10⁶ cellule/mL è consigliato come punto di partenza.
2. Cellule di placcatura
   1. Posto una goccia di 10 µ l di sospensione cellulare al centro di ogni vetrino coprioggetto del collagene IV rivestito vetro 12-pozzetti piastra inferiore senza toccare o graffiare il rivestimento (Figura 1A, B). Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C, atmosfera umidificata, per consentire le celle da collegare. Check-in un microscopio invertito che le cellule siano collegate.
      Nota: Questo può essere meglio visto al bordo della goccia, dove la formazione di un monostrato possa essere osservati (Figura 1C). Se necessario, incubare la piastra fino a 3 h. Assicurarsi che l'umidità nell'incubatrice è abbastanza alto come le gocce possono asciugare rapidamente. Se si osserva una riduzione del volume goccia durante questo passaggio, è possibile aggiungere PBS negli spazi tra i pozzetti per aumentare l'umidità.
   2. Lavare delicatamente i pozzetti con 1 mL di terreno di coltura due volte per rimuovere le cellule non iscritti. Aggiungere 1 mL terreno di coltura ad ogni pozzetto. Il check-in un microscopio invertito che nessuna cellula galleggiante rimangono, in caso contrario lavare i pozzetti nuovamente. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO₂, atmosfera umidificata, per ottenere strati delle cellule ben definito.
      Nota: Le cellule galleggianti sono probabili di ri-collegare alla piastra e per formare le colonie delle cellule indesiderate.

3. stimolare le cellule (giorno 3)

1. Controllare tutti i pozzetti utilizzando un microscopio inverso per garantire tale cella colonie sono cresciuti correttamente. Se necessario, contrassegnare pozzi inadatti e non li uso.
2. Etichettare ogni pozzetto della piastra in modo appropriato per ogni condizione di indagato. Eseguire ogni condizione in doppio o triplice copia.
3. Modificare il mezzo per morire di fame le cellule in DMEM/F12 contenente 0,1% di siero equino (media affamato) 3 h prima che le cellule sono stimolate.
4. Stimolano le cellule mediante aggiunta di EGF (concentrazione finale di 5 ng/mL) o altri mediatori desiderate e mescolare delicatamente il mezzo usando una micropipetta di 1 mL o agitando la piastra.
5. Incubare la piastra per 1-4 giorni per osservare lo spostamento del bordo e bordo contorno come descritto nella sezione 4.1 o eseguire time-lapse imaging come descritto nel paragrafo 4.2.

4. visualizzazione delle colonie delle cellule e migrazione cellulare

1. Ematossilina-eosina (lui) per misurare la crescita di Colonia (giorno 4-7)
   1. Difficoltà cellule in etanolo al 70% (1 mL/pozzetto) per ~ 2 min.
   2. Macchia i nuclei con ematossilina (1 mL/pozzetto), ~ 2 min.
   3. Cellule di lavare con acqua di rubinetto (1 mL/pozzetto) fino a quando i nuclei sono blue, 5-10 min.
   4. Macchia di citoplasma con eosina (1 mL/pozzetto), ~ 2 min.
   5. Risciacquare con acqua deionizzata (1 mL/pozzetto).
      Nota: Soluzioni di ematossilina ed eosina possono essere raccolti e utilizzati più volte fino a quando la colorazione diventa debole.
   6. Asciugare la piastra.
   7. Capovolgere la piastra e misurare il diametro del puntino con un righello. In alternativa, prendere le immagini della piastra con una macchina fotografica e analizzare il diametro del puntino in ImageJ.
2. Time-lapse microscopia (giorno 3)
   1. Accendere il microscopio di incubatrice e regolare la temperatura a 37 ° C. Riempire l'umidificatore con dH₂O. Adjust la CO₂ al 5%. Assicurarsi che la camera dell'incubatore è umidificata e che il tavolino motorizzato può muoversi liberamente. Chiudere la camera incubatrice e consentire il microscopio regolare a 37 ° C.
      Nota: Il microscopio (Vedi la tabella materiali) utilizzato qui deve essere riscaldato a 37 ° C per almeno 3 ore prima che le cellule sono Imaging per evitare alla deriva della messa a fuoco.
   2. Posizionare la piastra sul palco del microscopio incubatrice e impostare l'elenco di fase. Due bordi opposti immagine e al centro di ogni punto della cella (Figura 1A).
   3. Prendere immagini ogni 3 min, per 15-24 h utilizzando l'obiettivo 10x. Scaricare i dati e procedere con l'analisi di immagine in un programma di scelta, ad esempio, ImageJ o Matlab.

Risultati

Il dosaggio di puntino qui presentato (Figura 1) è stato effettuato usando dilagante, colonie del polmone cellule di cancro al seno (MCF10CA1a) come sistema modello. Il dosaggio di puntino produce punti di cellule altamente riproducibile anche in mano di principianti, che lo rende un comodo e facile da eseguire test (Figura 1D). Il dosaggio di dot combinato con lui la macchiatura, o l'imaging time-lapse e succes...

Discussione

Durante le cellule di progressione del tumore migrano dal tessuto di origine di invadere il tessuto circostante e riprodurrsi per metastasi ai siti distanti¹⁵. Migrazione delle cellule da una colonia di cellule può essere osservato nell'analisi della dot. Qui, il dosaggio di dot è illustrato analizzando il fenotipo migratorio delle cellule di cancro al seno umano in risposta a EGF.

Per ottenere risultati accurati e riproducibili diverse fasi d'impostazione del punto s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF10CA1a cells	Karmanos Research Institute	N/A	cells used for assay
mouse collagen IV	BD Biosciences	354233	used to coat plates
trypsin / EDTA	Thermo Fisher	25300054	used to remove cells from tissue culture plates
DPBS	Mediatech	21-031-CV	used to wash cells
DMEM / F12	Thermo Fisher	11320082	used as culture medium
horse serum	Thermo Fisher	26050088	used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F	used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant)	Peprotech	AF-100-15	used to stimulate cells
fatty acid free BSA	Sigma	A8806-1G	used to make buffer for EGF
hematoxylin	Sigma	HHS32	used to stain colonies
eosin	Electron Microscopy Sciences	26051-10	used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator	Sanyo	model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage	Zeiss	model Axio Observer.Z1	used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera	BioVision	C11440-42U-KIT	used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph	BioVision	MMACQMIC	software used for time lapse imaging
inverted microscope	Olympus	model IX70	used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box	Lock&Lock	N/A	used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)