بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

Summary

ابيكارديوم يلعب دوراً حاسما في التنمية وإصلاح القلب بتوفير عوامل النمو على الجدار احتشاء عضلة القلب وخلايا. هنا، يمكننا وصف أسلوب للثقافة البشرية خلايا epicardial الأساسية التي تمكن من دراسة ومقارنة الخصائص الإنمائية والكبار ل.

Abstract

ابيكارديوم، طبقة خلايا الظهارية تغطي عضلة القلب، له دور أساسي أثناء تطوير القلب، وكذلك في الاستجابة إصلاح القلب بعد الإصابة الدماغية. عند تنشيط، خلايا epicardial الخضوع لعملية تعرف باسم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) لتوفير خلايا عضلة القلب تجديد. وعلاوة على ذلك، يساهم ابيكارديوم عن طريق إفراز العوامل الأساسية باراكريني. نقدر تماما إمكانات التجدد ابيكارديوم، مطلوب نموذج خلية بشرية. هنا أننا مخطط نموذج ثقافة رواية خلية استخلاص الخلايا الأولية المشتقة ابيكارديال (ابدكس) من أنسجة القلب الكبار والأجنة البشرية. لعزل ابدكس، ابيكارديوم تشريح من خارج العينة القلب ومعالجتها في تعليق خلية مفردة. المقبل، مطلي ابدكس ومثقف في أبدك المتوسطة التي تحتوي على مثبطات 5-كيناز كيه SB431542 للحفاظ على النمط الظاهري الظهارية بهم. EMT هو فعل التحفيز مع TGFβ. هذا الأسلوب يتيح، للمرة الأولى، دراسة عملية EMT epicardial البشرية في إعداد التي تسيطر عليها، وتيسر الحصول على مزيد من التبصر في سيكريتومي ابدكس التي يمكن أن تساعد في إنعاش القلب. وعلاوة على ذلك، يتيح هذا النهج الموحد للمقارنة المباشرة للسلوك ابيكارديال الكبار والجنين البشري.

Introduction

ابيكارديوم، طبقة طلائي خلية واحدة أن مغلفات القلب، وذات أهمية حيوية للتنمية القلب وإصلاح (إعادة النظر في سميتس et al. ¹)-تنمويا، ابيكارديوم تنشأ من الجهاز بروبيكارديال، هيكل صغير يقع في قاعدة القلب النامية. حول التنموية يوم E9.5 في الماوس، والحمل بعد 4 أسابيع في الإنسان، تبدأ الخلايا ترحيل من هذا الهيكل قرنبيط ويغطي عضلة القلب النامية². حالما يتم تشكيل طبقة واحدة من خلايا الظهارية، يخضع جزء من الخلايا epicardial الظهارية الانتقالية الوسيطة (EMT). خلال EMT، خلايا تفقد خصائصها الظهارية، مثل الالتصاقات خلية خلية، والحصول النمط الظاهري الوسيطة التي يعطيها القدرة على ترحيل في عضلة القلب النامية. شكلت الخلايا المشتقة ابيكارديال (ابدكس) يمكن أن تفرق في العديد من أنواع خلايا القلب بما في ذلك الخلايا الليفية وخلايا العضلات الملساء، ويحتمل أن تكون كارديوميوسيتيس وخلايا بطانية³، رغم التمايز الأخير اثنين الخلية السكان لا يزال خاضعا للمناقشة (استعرض في سميتس et al. ⁴). وعلاوة على ذلك، يوفر ابيكارديوم إشارات paracrine مفيدة لعضلة القلب لتنظيم النمو والأوعية الدموية^5،6،،من⁷⁸. وقد أثبتت الدراسات المتعددة أن تشكيل epicardial البصر يؤدي إلى عيوب التنموية في عضلة القلب^9،10والمفرج¹¹والتوصيل نظام¹²، إذ تؤكد الأساسية مساهمة ابيكارديوم إلى تشكيل القلب.

على الرغم من أن في قلب الكبار موجودة ابيكارديوم كطبقة نائمة، فإنه يصبح تنشيط عند الاسكيمية¹³. ويجمل تنشيط epicardial بعد إصابة العديد من العمليات الموصوفة للتنمية القلب، بما في ذلك انتشار و EMT¹⁴، أن كان أقل كفاءة. من المثير للاهتمام، على الرغم من أن الآلية الدقيقة ليست مفهومة تماما، ابيكارديال المساهمة في إصلاح يمكن تحسينه من خلال العلاج مع، مثلاً، β4 ثيموسين¹⁵ أو تعديل مرناً VEGF-أ¹⁶، أسفر عن القلب يحسن وظيفة بعد احتشاء عضلة القلب. ولذلك يعتبر ابيكارديوم مصدر خلية مثيرة لاهتمام لتعزيز إصلاح الذاتية للقلب المصاب.

وكثيراً ما يرد موجز لها آليات التنمية القلب أثناء الإصابة، على الرغم من أن بطريقة أقل كفاءة. بحثاً عن المنشطات ابيكارديال، فمن بالغ الأهمية أن نتمكن من تحديد ومقارنة القدرات الكاملة ابيكارديوم الجنين والكبار. وعلاوة على ذلك، من المهم من وجهة نظر علاجية، أنه، بالإضافة إلى التجارب على الحيوانات، نتقدم بالمعرفة فيما يتعلق برد ابيكارديوم البشرية. هنا، يمكننا وصف طريقة لعزل وثقافة الكبار والجنين epicardial المشتقة الخلايا البشرية (ابدكس) في مورفولوجيا مثل الخلايا الظهارية وحمل EMT. مع هذا النموذج، ونحن نهدف إلى استكشاف ومقارنة سلوك الخلية epicardial الكبار والجنين.

والميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو استخدام المواد ابيكارديال البشرية، التي لم تدرس جيدا. الأهم من ذلك، ينص البروتوكول ثقافة العزلة وخلية وصف أسلوب موحد واحد لاشتقاق كلا ابدكس cobble الأجنة والبالغين، مما يتيح إجراء مقارنة مباشرة بين هذه المصادر الخلية اثنين. بالإضافة إلى ذلك، منذ ابيكارديوم يتم عزل استناداً إلى موقعها، تكفل أن الخلايا هي فعلا ابيكارديالي المشتقة¹⁷.

في حين تم إنشاء أساليب العزلة أبدك البشرية سابقا، هذه تعتمد في الغالب على بروتوكولات ثمرة حيث يتم مطلي قطعة من أنسجة القلب أو ابيكارديال على خلية ثقافة طبق^18،19. وبالتالي يحدد هذا النهج على وجه التحديد للخلايا التي تفقد جزئيا على النمط الظاهري الظهارية من أجل ترحيل، والتي أكثر عرضه للخضوع EMT عفوية. في البروتوكول الحالي، تتم معالجتها في ابيكارديوم أولاً إلى حل وحيد خلية الذي يسمح ابدكس معزولة للحفاظ على دولته الظهارية. ولذلك يوفر هذا الأسلوب نموذجا صلبا في المختبر لدراسة epicardial EMT.

Protocol

كل التجارب مع عينات الأنسجة البشرية أقرتها لجنة الأخلاقيات المركز الطبي بجامعة ليدن، ويتفق مع "إعلان هلسنكي". يتم تنفيذ كافة الخطوات مع المعدات المعقمة في تدفق ثقافة الخليوي مجلس الوزراء.

1-الأعمال التحضيرية

1. إعداد متوسطة أبدك بخلط دولبيكو للمتوسطة تعديل النسر (دميم منخفضة-الجلوكوز) والمتوسطة 199 (M199) بنسبة 1:1. أضف إبطال الحرارة 10% مصل بقرى الجنين (FBS، الحرارة غير نشط لمدة 25 دقيقة في 56 درجة مئوية) والملحق مع 100 البنسلين يو/مليلتر وستربتوميسين 100 ملغ/مل. قبل الحارة المتوسطة أبدك في حمام مائي 37 درجة مئوية.
2. قبل الحارة التربسين 0.25%/EDTA (1:1) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. معطف الآبار مع الجيلاتين. إضافة 0.1% جيلاتين/برنامج تلفزيوني لكل بئر واحتضان لوحات لمدة 15 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية. ويرد في الجدول 1المبادئ التوجيهية للوحة الثقافة الخلية المطلوبة. بعناية إزالة جميع السوائل قبل طلاء الخلايا.
4. إعداد حل أسهم من 10 مم SB431542 (SB)، تضعف في [دمس] (تحذير). جعل 50 ميليلتر مختبرين في أنابيب الطرد المركزي البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي، مثل أنابيب ايبندورف، وتخزينها في-20 درجة مئوية. لاحظ أنه يمكن أن يكون مذاب مختبرين SB مرة واحدة فقط.

2-استرجاع وتخزين العينات قلب الكبار والجنين

1. تخزين اذينات الكبار البشرية مباشرة عند إزالة أثناء عملية جراحية في أنبوب 50 مل مع 15 مل دميم الجلوكوز العالية التي تحتوي على 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 مغ/مل عند 4 درجة مئوية. بشكل عام من 3-5 سم في حجم العينات ويمكن تخزين تصل إلى 48 ساعة بعد التشريح.
2. تخزين قلوب الأجنة التي تم الحصول عليها من مواد الإجهاض الاختيارية في المتوسط أبدك عند 4 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة بعد عزلة. لهذا البروتوكول، واستخدام العينات مع عمر الحملي بين 12-22 أسبوعا. علما بأن قلب كله يمكن أن تستخدم لعزل ابيكارديوم.

3-عزل طبقة ابيكارديال

1. تدفق الصفحي مجلس الوزراء، تحضير طبق زراعة خلايا 100 ملم مع برنامج تلفزيوني ومكان معالجة تجميعية منفصلة (~ 200 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني في الغطاء. ملء أنبوب 15 مل مع 5 مل المعالجون مسبقاً أبدك المتوسطة.
2. وضع الأنسجة في الطبق خلية ثقافة مليئة ببرنامج تلفزيوني. تأكد من أن الأنسجة هو مبلل كثيرا أثناء الإجراء.
3. استخدام ستيريوميكروسكوبي، إزالة قدر من طبقة ابيكارديال من عينة الأنسجة قدر الإمكان يسقط استخدام الملقط.
   ملاحظة: يمكن التعرف ابيكارديوم كطبقة رقيقة جداً وشفافة محكم انضمت إلى خارج القلب (الشكل 1A). في محاولة لتجنب التلوث مع epicardial الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية منذ هذا سوف تعوق العزلة.
4. جمع قطع من الأنسجة ابيكارديال في الحبرية من برنامج تلفزيوني على الغطاء.
5. قطع الأنسجة ابيكارديال إلى قطع صغيرة (0.5 مم³) استخدام مشرط (الشكل 1B)، أو باستخدام نصائح حادة من ملقط صغير. ملاحظة أن القطع يجب أن تكون قادرة على تمرير P1، 000 بيبيت نصيحة (الخطوة 3، 6).
6. أضف 1 مل التربسين للأنسجة ابيكارديال وجمع القطع والتربسين مع P1، 000 بيبيت تلميح. نقل الأنسجة في أنبوب 1.5 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي (الشكل 1).
7. احتضان الأنبوبة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، بينما تهز ~ 60 لفة في الدقيقة.
8. إزالة الأنبوب من حوض ماء، وتنظيف الجزء الخارجي الأنبوب مع الإيثانول 70%.
9. تسمح الأنسجة تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب (الشكل 1) ونقل المادة طافية تحتوي على خلايا ابيكارديال إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 5 مل أبدك المتوسطة لإلغاء تنشيط التربسين عناية.
10. تجديد الأنسجة المتبقية في الأنبوب الطرد المركزي المخروطية مع التربسين 1 مل، وتخلط بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
11. كرر الخطوة 3، 3، 7 إلى 10 مرتين. في الخطوة الأخيرة، بعد ما مجموعة 30 دقيقة من حضانة التربسين، نقل المادة طافية والأنسجة ابيكارديال المتبقية في أنبوب يحتوي على أبدك المتوسطة.
12. عندما يتم جمع كافة الخلايا في المتوسط أبدك، بلطف تمرير التعليق عن طريق حقنه 10 مل بإبرة قياس 19 في أنبوب 15 مل جديدة أن تنأى ميكانيكيا بالخلايا (الشكل 1E).
    ملاحظة: تأكد من مجانسة التعليق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً قبل تمرير الحل عن طريق الإبرة لمنع الإبرة الحصول على إعاقة.
13. للمزيد ننأى بالخلايا، كرر الخطوة 3.12 بإبرة قياس 21.
14. ضع مصفاة خلية 100 ميكرومتر على رأس أنبوب 50 مل ونقل متوسطة تحتوي على خلايا ابيكارديال على مصفاة استخدام ماصة 10 مل لإزالة كافة كتل المتبقية (الشكل 1F).
15. أغسل مصفاة لجمع الخلايا المتبقية من بيبيتينج 5 مل أبدك المتوسطة إلى المصفاة.
16. بيبيت تعليق خلية من أنبوب 50 مل في أنبوب 15 مل. منذ بالوعة الخلايا إلى الجزء السفلي من الأنبوب، اهتز الحل بلطف قبل بيبيتينج.
    ملاحظة: في حين أن هذه الخطوة ليست ضرورية، أنبوب أصغر الإيدز التصور بيليه بعد الطرد المركزي.
17. الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).
18. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية (الشكل 1 ح) في وحدة التخزين المطلوب من أبدك المتوسطة (الجدول 1).
    ملاحظة: للجنين ابدكس، مباشرة استخدام أبدك المتوسطة التي تحتوي على 10 ميكرون من مثبط كيناز ALK5 (أبدك + س). يمكن مطلي خلايا البالغين دون SB أثناء مرور أول.
19. لوحة تعليق خلية على لوحات الثقافة الجيلاتين المغلفة (1I الشكل). يعتمد حجم البئر على حجم العينة الأنسجة ابيكارديال (الجدول 1). علما أن كونفلوينسي المنخفضة سوف تحفز حدوث EMT.
20. وضع الخلايا في الحاضنة لمالا يقل عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂ للسماح للخلايا لإرفاق لوحة الثقافة.

4-ثقافة ابدكس

1. تجديد المتوسطة أبدك + SB على الأقل كل 3 أيام.
2. فحص الخلايا على الأقل كل 3 أيام باستخدام المجهر. عندما تصل الخلايا إلى كونفلوينسي، أيعند لوحة الثقافة مغطى تماما بالخلايا، وممر الخلايا بنسبة 1:2 سطحية. ملاحظة يمكن أن يستغرق التوصل إلى كونفلوينسي ~ 5-10 أيام.
   1. نضح المتوسطة استخدام نظام الشفط أو بيبيت مع، مثلاً، بيبيت زجاج.
   2. غسل الخلايا بعناية عن طريق إضافة برنامج تلفزيوني للخلايا. بلطف دوامة اللوحة ونضح برنامج تلفزيوني.
   3. إضافة التربسين اللوحة. تدوير بلطف لوحة لتغطية كافة الخلايا مع التربسين واحتضان لوحة لمدة 1 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم التربسين قليلاً قدر الإمكان (إشارة: لوحة 200 ميليلتر الواحدة من 6 جيدا جيدا)
   4. انقر فوق لوحة ميكانيكيا فصل الخلايا من الجزء السفلي من اللوحة. استخدام المجهر للتحقق بصريا إذا فصل الخلايا. إذا لم يكن الأمر كذلك، احتضان لوحة الثقافة الخلية دقيقة إضافية.
   5. إضافة وحدة التخزين المطلوبة من أبدك + SB المتوسطة للخلايا وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، ونقل تعليق خلية لوح جيلاتين مغلفة ثقافة جديدة.
      ملاحظة: بشكل عام، الخلايا يمكن أن يوضع في مورفولوجيا حصاة كبيرة تصل إلى مرور 8.

5-تحريض EMT في ابدكس

1. للحث على EMT، ننأى بالخلايا مع التربسين ونقل الخلايا إلى الجيلاتين جديدة مغلفة بابار في نسبة 1:2 سطحية في المتوسط أبدك + بينالي الشارقة، كما هو موضح في 4، واحتضان لمالا يقل عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5% CO₂.
2. الاختيار إذا كونفلوينسي من 50-70%، وإذا ابدكس مورفولوجيا حصاة كبيرة.
   ملاحظة: كونفلوينسي يؤثر على قدرة ابدكس على الخضوع EMT.
3. نضح المتوسطة من الخلايا، وتغسل الخلايا بعناية مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 4.2.1-4-2-2).
4. تنشيط الخلايا مع 1 نانوغرام/مل TGFβ3 في المتوسط أبدك ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية، 5% CO₂ لمدة 5 أيام. علما بأن خلال التحفيز، وليس لديه المتوسطة أبدك التي تحتوي على TGFβ3 أن تتجدد.
5. رصد الخلايا يوميا. بعد 5 أيام، يتم التعرف على الخلايا التي خضع EMT بالتشكل على شكل محور الدوران (الشكل 2A).
6. الثقافة على شكل شوكي ابدكس وفقا للطريقة الموضحة في 4 دون SB أو TGFβ بالإضافة إلى المتوسطة أبدك. لاحظ أنه بشكل عام، يمكن مثقف ابدكس على شكل المغزل حتى مرور 20.
7. التحقق من صحة وقوع EMT مع تلطيخ إيمونوفلوريسسينت باستخدام أجسام مضادة ضد αSMA علامات الوسيطة أو فيمنتين أو فالويدين للكشف عن تشكيل ألياف الأكتين و الإجهاد (الشكل 2)، أو باستخدام qRT PCR EMT-المتعلقة الجينات ( مثل، WT1، بيريوستين، Col1A1، αSMA، N-كادهيرين، MMP3، الحلزون، سبيكة) (الشكل 2 و الجدول 2).

النتائج

هنا، فإننا مخطط بروتوكولا مباشرة عزل ابدكس من الكبار والجنين القلب الأنسجة البشرية (الشكل 1). هذا البروتوكول يستفيد من موقع يمكن الوصول بسهولة ابيكارديوم في خارج القلب (الشكل 1A). تلوين لصوان القلب بعد تشريح يوضح أنه يتم إزالة ابيكارديوم WT1 +...

Discussion

هنا يصف لنا البروتوكول مفصلاً لعزل وثقافة الخلايا epicardial الأولية المستمدة من قلوب الكبار والأجنة البشرية. وقد وصف واسع النطاق لهذه الخلايا المنشورة سابقا¹⁷. وقد أظهرنا أنه يمكن الحفاظ على كل أنواع الخلايا كالخلايا الظهارية مثل حصاة كبيرة عند مثقف مع مثبط كيناز ALK5 SB431542. EMT جزء ل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083