הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

Summary

Epicardium ממלאת תפקיד מכריע ההתפתחות והתיקון של הלב על ידי מתן תאים גורמי גדילה לדופן שריר הלב. כאן, אנו מתארים שיטה לתאי epicardial ראשי האדם תרבות המאפשרת את המחקר והשוואה בין המאפיינים שלהם למבוגרים ובעיות התפתחותיות.

Abstract

Epicardium, שכבת תאים אפיתל כיסוי שריר הלב, יש תפקיד חיוני במהלך התפתחות הלב, כמו גם התגובה תיקון הלב לאחר פציעה איסכמי. כאשר מופעלת, תאים epicardial עוברים תהליך המכונה אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים) כדי לספק לתאי שריר הלב ההתחדשות. יתר על כן, epicardium תורמת באמצעות הפרשת גורמים חיוניים paracrine. כדי להעריך את פוטנציאל הרגנרציה של epicardium, דרושה דוגמנית התא האנושי. כאן אנחנו חלוקה לרמות מודל תרבות תא הרומן לנבוע ראשי תאים נגזר epicardial (EPDCs) ברקמת הלב האנושי למבוגרים ו עוברית. כדי לבודד EPDCs, epicardium גזור מבחוץ של הדגימה הלב, מעובד להשעיה תא בודד. בשלב הבא, EPDCs מצופה, תרבותי EPDC בינוני המכיל את המדכא 5-קינאז ALK SB431542 לשמור על פנוטיפ אפיתל שלהם. החובשים הנגרמת על ידי גירוי עם TGFβ. שיטה זו מאפשרת, לראשונה, חקר התהליך של החובשים epicardial אנושית בסביבה מבוקרת, ומקל צובר יותר על בסיס secretome של EPDCs עשוי לסייע הלב התחדשות. יתר על כן, גישה אחידה זו מאפשרת השוואה ישירה ההתנהגות האנושית למבוגרים ו עוברית epicardial.

Introduction

Epicardium, שכבת האפיתל תא בודד מעטפות הלב, הוא בעל חשיבות פיתוח הלב ותיקון (נבדקה בסמיתס. ואח ¹). נכה, epicardium נובע העוגב proepicardial, מבנה קטן הממוקם בבסיס הלב המתפתח. סביב יום התפתחותית E9.5 העכבר ולאחר 4 שבועות תפיסה פוסט-אנוש, התאים להתחיל להעביר מתוך מבנה כרובית ולכסות את שריר הלב המתפתח². ברגע נוצרת שכבה תא אפיתל בודד, חלק מהתאים epicardial עובר אפיתל המעבר mesenchymal (החובשים). במהלך אמבולנס, תאים לאבד את מאפייני האפיתל שלהם, כגון תאים תאים הדבקויות, ולקבל הפנוטיפ mesenchymal אשר נותן להם את היכולת להעביר לתוך שריר הלב המתפתח. התאים נגזר epicardial בנוי (EPDCs) יכולים להתמיין מספר סוגי תאים הלב כולל fibroblasts, תאי שריר חלק, ואת פוטנציאל cardiomyocytes תאי אנדותל³, למרות בידול של האחרונים שני תא האוכלוסיות נותר כפוף הדיון (נבדקה בסמיתס. et al. ⁴). יתרה מכך, epicardium מספק אותות paracrine מאלף אל שריר הלב כדי לווסת את הצמיחה ואת vascularization^5,6,7,8. מחקרים רבים הוכיחו כי היווצרות epicardial לקוי מוביל ליקויים התפתחותיים-שריר הלב^9,10, להערכת¹¹, הולכה מערכת¹², תוך שימת דגש ארומטיים התרומה של epicardium את היווצרות של הלב.

למרות בלב למבוגרים epicardium קיים כשכבה רדום, זה הופך להפעיל על איסכמיה¹³. Epicardial הפעלה מחדש לאחר פציעה recapitulates מספר התהליכים המתוארים לפיתוח לב, כולל הפצת החובשים¹⁴, אם כי פחות ביעילות. מעניין, למרות המנגנון המדויק אינה מובנת במלואה, התרומה epicardial לתקן ניתן לשפר על ידי טיפול עם, למשל, β4? ואת מוכנה¹⁵ או שונו VEGF-A mRNA¹⁶, וכתוצאה מכך יושבחו דום לב פונקציה לאחר אוטם שריר הלב. Epicardium ולכן היא נחשבת מקור תא מעניינים לשיפור ותיקון אנדוגני של הלב הפצוע.

מנגנוני התפתחות הלב הם לעתים קרובות recapitulated במהלך פציעה, אם כי באופן פחות יעיל. בחיפוש אחר מפעילים epicardial, זה בעל חשיבות עליונה. כי אנחנו יכולים לקבוע ולהשוות לקיבולת המלאה של epicardium העובר ואת למבוגרים. יתר על כן, מנקודת מבט טיפולית, זה חשוב, בנוסף לניסויים בבעלי חיים, אנו להרחיב ידע לגבי התגובה של epicardium האנושית. כאן, אנו מתארים שיטה לבודד, תרבות למבוגרים ו עוברית epicardial נגזר תאים אנושיים (EPDCs) במורפולוגיה אפיתל תאים דמויי, כדי לעודד את החובשים. במודל זה, אנו שואפים לחקור ולהשוות בהתנהגות התא epicardial למבוגרים ו עוברית.

היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש של חומר epicardial האנושי, אשר לא נחקרה ביסודיות. חשוב, פרוטוקול תרבות המתואר, בידוד ותא מספק שיטה אחידה אחת להפיק שני EPDCs חלוק עוברית, למבוגרים, המאפשרים השוואה ישירה בין מקורות שני תאים אלה. בנוסף, מאז epicardium הוא מבודד בהתבסס על המיקום שלו, זה מובטחת כי התאים נמצאים למעשה נגזרת epicardially¹⁷.

בעוד האדם שיטות בידוד EPDC הוקמו בעבר, אלה בעיקר להסתמך על פרוטוקולים תוצר איפה פיסות רקמת לב או epicardial הם מצופה על^18,19מאכל התרבות התא. גישה זו בוחר ובכך במיוחד עבור תאים זה חלקית לאבד פנוטיפ אפיתל שלהם על מנת להעביר, ו זה נוטים יותר עוברים החובשים ספונטנית. בפרוטוקול הנוכחי, epicardium שהוא מעובד תחילה פתרון תא בודד אשר מאפשר את EPDCs מבודד לשמור על מצב אפיתל שלהם. שיטה זו מספקת ולכן מודל מוצק במבחנה ללמוד החובשים epicardial.

Protocol

כל ניסויים עם דגימות רקמה אנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ליידן, תואמת הצהרת הלסינקי. כל השלבים מתבצעות עם ציוד סטרילי בתוך זרם תרבות תא ארון.

1. תכשירים

1. הכן EPDC בינוני על ידי ערבוב של Dulbecco של הנשר ששונה בינונית (DMEM נמוך-גלוקוז), בינוני 199 (M199) על יחס 1:1. להוסיף 10% חום להשבית סרום שור עוברית (FBS, החום לא פעיל במשך 25 דקות ב- 56 ° C) והשלמה עם פניצילין U/mL 100, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין. לחמם את המדיום EPDC באמבט מים 37 º C.
2. לחמם טריפסין 0.25%/EDTA (1:1) בתוך אמבט מים 37 º C.
3. המעיל וולס עם ג'לטין. להוסיף ג'לטין 0.1% / PBS מכל קידוח, דגירה הלוחות למשך לפחות 15 דקות ב 37 º C. הנחיות לצלחת תרבות תא נדרש מסוכמים בטבלה1. הסר בזהירות את כל הנוזלים לפני ציפוי תאים.
4. להכין מלאי פתרון של 10 מ מ SB431542 (SB), מדולל דימתיל סולפוקסיד (זהירות). להפוך 50 µL aliquots צינורות פוליפרופילן צנטריפוגה התחתון חרוט, כמו צינורות גלאים, ואחסן אותם ב-20 ° C. שימו לב כי SB aliquots יכול להיות הקרת פעם אחת בלבד.

2. אחזור ואחסון של הלב העוברי ובגירים דגימות

1. לאחסן האנושי למבוגרים auricles ישירות על הסרת במהלך ניתוח בצינור 50-mL עם 15 מ"ל DMEM גבוהה-גלוקוז המכיל 10% FBS, פניצילין U/mL 100 ו- 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין ב 4 º C. בדרך כלל 3-5 ס מ גודל ודוגמאות ניתן לאחסן עד 48 שעות לאחר ניתוח.
2. חנות ליבם עוברי המתקבל הפלה בחירה בחומר EPDC בינוני ב 4 ° C עד 24 שעות לאחר בידוד. עבור פרוטוקול זה, השתמש דגימות עם עידן הריונית בין שבועות 12-22. שימו לב כי ניתן להשתמש בלב שלם עבור בידוד של epicardium.

3. בידוד של השכבה Epicardial

1. בזרימה שכבתית cabinet, להכין תבשיל 100-מ מ תא-תרבות עם PBS ולמקם droplet נפרד (~ 200 µL) ל- PBS במכסה. למלא צינור 15-מ ל מ ל מראש ומחוממת EPDC בינונית.
2. המקום הרקמה לתוך המנה תרבית תאים מלאים PBS. ודא כי הרקמה הוא לחלח לעתים קרובות במהלך ההליך.
3. שימוש של stereomicroscope, להסיר כל כך הרבה של השכבה epicardial מהרקמה ככל האפשר על ידי מתקלפת זה באמצעות מלקחיים.
   הערה: epicardium ניתן לזהות כמו שכבה דקה מאוד, שקוף בחוזקה דבקה החיצוני של הלב (איור 1 א'). נסה להימנע זיהום עם רקמת שומן epicardial וכלי הדם, מאז זה ה"בלתי הבידוד.
4. לאסוף את חתיכות רקמה epicardial ה-droplet של PBS על המכסה.
5. חותכים את הרקמה epicardial לחתיכות קטנות (0.5 מ מ³) באמצעות אזמל (איור 1B), או באמצעות קצות חדה מלקחיים קטנים. שימו לב כי החלקים צריך להיות מסוגל להעביר עם P1, pipet 000 עצה (שלב 3.6).
6. להוסיף 1 מ"ל של טריפסין הרקמה epicardial, לאסוף את השברים טריפסין עם P1, 000 pipet עצה. להעביר את הרקמה לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 1.5-mL (איור 1C).
7. דגירה הצינורית בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, תוך כדי טלטול-~ 60 סל ד.
8. הסר את הצינור לאמבט מים, ולנקות החיצוני של הצינור עם 70% אתנול.
9. לאפשר את הרקמה לשקוע לתחתית הצינור (איור 1D) ולהעביר בזהירות את תגובת שיקוע המכיל תאים epicardial אל הצינור 15-mL המכיל 5 מ"ל בינוני EPDC כדי להשבית את טריפסין.
10. לחדש את הרקמה שנותרה בצינור צנטריפוגה חרוט עם טריפסין 1 מ"ל ומערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
11. חזור על שלב 3.7 כדי 3.10 פעמיים. בשלב הסופי, לאחר סך של 30 דקות של דגירה טריפסין, להעביר את תגובת שיקוע והן את הרקמה epicardial הנותרים לתוך הצינור המכיל EPDC בינונית.
12. כאשר כל התאים נאספים EPDC בינוני, בעדינות עוברים ההשעיה מזרק 10-mL עם מחט 19-מד לתוך צינור 15-mL החדש מכנית מביצועם התאים (איור 1E).
    הערה: הקפד homogenize התליה על-ידי pipetting למעלה ולמטה עוברים גם הפתרון המחט כדי למנוע את המחט מקבל נחסמת.
13. בהמשך מביצועם התאים, חזור על שלב 3.12 עם מחט 21-מד.
14. מניחים מסננת תא 100-מיקרומטר על גבי צינור 50-mL ולהעביר את המדיום המכילות את התאים epicardial על גבי מסננת באמצעות פיפטה של 10-mL כדי להסיר כל גושים שנותרו (איור 1F).
15. לשטוף את מסננת כדי לאסוף תאים שיורית מאת pipetting בינוני EPDC מ על גבי מסננת.
16. Pipet התליה תא מהצינור 50-mL לתוך צינור 15-mL. מאז התאים שוקעים לתחתית הצינור, לנער את הפתרון בעדינות לפני pipetting.
    הערה: במהלך השלב זה לא הכרחי, צינור יותר קטן עזרי ויזואליזציה של בגדר לאחר צנטריפוגה.
17. צנטריפוגה-200 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר (איור 1 ג'י).
18. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא (איור 1 H) בהיקף הנדרש EPDC בינוני (טבלה 1).
    הערה: עבור העובר EPDCs, להשתמש ישירות EPDC בינוני המכיל 10 מיקרומטר של המדכא קינאז ALK5 (EPDC + SB). יכול להיות מצופה תאים בוגרים ללא SB במהלך המעבר הראשון.
19. צלחת התליה תא על תרבות ג'לטין מצופה הלוחות (איור 1I). הגודל של הבאר תלוי בגודל של דגימת הרקמות epicardial (טבלה 1). שימו לב כי confluency נמוך יניעו את המופע של החובשים.
20. מקם את התאים בחממה לפחות 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ כדי לאפשר את התאים לצרף הצלחת תרבות.

4. תרבות של EPDCs

1. לחדש את המדיום EPDC + SB לפחות כל 3 ימים.
2. לבדוק את התאים לפחות כל 3 ימים באמצעות המיקרוסקופ. כאשר התאים מגיעים confluency, דהיינו, כאשר לוח תרבות מכוסה עם תאים, המעבר את התאים על יחס שטח של 1:2. שימו לב כי להגיע confluency יכול לקחת ~ 5-10 ימים.
   1. האחות המדיום באמצעות pipet או מערכת השאיפה עם, למשל, pipet זכוכית.
   2. לשטוף את התאים בקפידה על-ידי הוספת PBS לתאים. בעדינות מערבולת את הצלחת, מחוק לגמרי מגניב.
   3. הוסף טריפסין לצלחת. סובב בעדינות את הצלחת לכסות את כל התאים עם טריפסין, דגירה את הצלחת. בשביל 1 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: השתמש כמו טריפסין קטן ככל האפשר (אינדיקציה: µL 200 לאדם טוב של 6 טוב צלחת)
   4. הקש את הצלחת לנתק באופן מכני את התאים מהחלק התחתון של הלוח. השתמש במיקרוסקופ כדי בדיקה חזותית אם התאים יש מנותק. אם לא, תקופת דגירה לצלחת תרבות תא של רגע מיותר.
   5. להוסיף נפח בינוני EPDC + SB הנדרש לתאים, resuspend על ידי pipetting למעלה ולמטה, להעביר התליה תא צלחת חדשה של תרבות ג'לטין מצופה.
      הערה: באופן כללי, תאים יכולים להישמר מורפולוגיה המרוצף עד המעבר 8.

5. אינדוקציה של החובשים ב- EPDCs

1. לזירוז החובשים, לנתק את התאים עם טריפסין והעברת התאים לג'לטין חדש מצופה בארות על יחס 1:2 משטח EPDC + SB בינוני, כפי שמתואר 4 ולאחר תקופת דגירה של פחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂.
2. הסימון אם confluency הוא 50-70%, ואם EPDCs מורפולוגיה המרוצף.
   הערה: Confluency משפיע על היכולת של EPDCs לעבור החובשים.
3. האחות המדיום מתאי ולשטוף את התאים בזהירות עם PBS (ראה שלב 4.2.1 - 4.2.2).
4. לעורר תאים עם 1 ng/mL TGFβ3 EPDC בינוני ומניחים בתוך אינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ במשך 5 ימים. שימו לב כי במהלך גירוי, המדיום EPDC המכיל TGFβ3 אין המיועדים לחידוש מלאי.
5. נטר את התאים מדי יום. לאחר 5 ימים, תאים שעברו החובשים מזוהים עם מורפולוגיה בצורת כישור (איור 2 א).
6. תרבות בצורת פלך EPDCs על פי השיטה המתוארת ב- 4 ללא תוספת של SB או TGFβ למדיום EPDC. שימו לב: באופן כללי, פלך בצורת EPDCs יכול להיות מחונן עד מעבר 20
7. לאמת את המופע של החובשים עם צביעת immunofluorescent באמצעות נוגדנים נגד סמנים mesenchymal αSMA או Vimentin או phalloidin כדי לזהות את היווצרות F-אקטין מתח סיבים (איור 2B), או באמצעות PCR לרביעיית עבור גנים הקשורים החובשים ( למשל, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-קדהרין, MMP3, חילזון, שבלול) (איור 2C ו לטבלה 2).

תוצאות

כאן, אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול פשוטה כדי לבודד EPDCs מן האדם למבוגרים ו עוברית ברקמת הלב (איור 1). פרוטוקול זה מנצל מיקום נגיש epicardium בצד החיצוני של הלב (איור 1 א'). כתמים auricle הלב לאחר ניתוח מדגים כי WT1 + epicardium מוסר בעוד מטריצה חוץ-תאית subepicardial הבס?...

Discussion

כאן נתאר של פרוטוקול מפורט כדי לבודד והתרבות תאים epicardial הראשית נגזר לבבות אדם מבוגר ו עוברית. אפיון מקיף של תאים אלה כבר שפורסמו בעבר¹⁷. אנחנו הראו כי שני סוגי תאים יכול להישמר כתאי אפיתל ריצוף דמוי כאשר תרבותי עם החומר המדכא קינאז ALK5 SB431542. החובשים הוא חלק בלתי נפרד של הפעלת epicard...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083