人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

要約

心外膜細胞と心筋壁に成長因子を提供することによって開発し、中心部の修復に重要な役割を果たしています。ここでは、研究と彼らの発達と大人の特性の比較を可能にする培養ひと心外膜細胞に手法について述べる。

要約

心外膜, 心筋を覆う上皮細胞層は、虚血性損傷後、心臓の開発中に、心の修復反応での重要な役割にいます。アクティブになったとき、心外膜細胞は再生心筋細胞を提供するでは上皮間葉転換 (EMT) 知られているプロセスを経る。さらに、必須のパラクライン因子の分泌を介して、心外膜が貢献しています。心外膜の再生の可能性を完全に鑑賞するには、ひと細胞モデルが必要です。ここでは、人間の成人および胎児の心臓組織から一次派生心外膜細胞 (EPDCs) を導出する新規細胞培養モデルを概説します。EPDCs を分離するには、心外膜が心臓標本の外から解剖、単一細胞懸濁液に処理します。次に、EPDCs はメッキ、ALK 5-キナーゼ阻害剤の上皮性の表現型を維持するために SB431542 を含む追求培地で培養しました。EMT は TGFβ 刺激によって誘導されます。このメソッドは、制御された設定で人間の心外膜 EMT の過程の研究を有効にした最初の時間のため、心臓再生を助けることができる EPDCs の secretome でより多くの洞察を得ることが容易になります。さらに、この統一的なアプローチは、人間の成人および胎児心外膜挙動の直接比較のためことができます。

概要

心外膜、封筒、心は、極めて重要な心臓の開発と修理 (スミッツらの見直しのための単一細胞上皮層¹). 発達、心外膜に起因 proepicardial 器官の開発の中心部の底部にある小さな構造。マウス、および 4 週間後の概念で、人間の発達の日 E9.5、周辺細胞はこのカリフラワー構造からの移行し、開発心筋²をカバーを開始します。単一の上皮細胞層が形成され、一度心外膜細胞の一部は上皮間葉転換 (EMT) に行われます。EMT、中に細胞は細胞接着斑などの上皮性特性を失うし、それらの発展途上の心筋に移行する能力を与える間葉系の表現型を得る。後者の 2 つのセルが形成された心外膜派生セル (EPDCs) が線維芽細胞、平滑筋細胞、および可能性のある心筋細胞、内皮細胞³を含むいくつかの心筋細胞タイプに区別できます。集団のまま (スミッツらの見直し議論の対象と⁴). さらに、心外膜、その成長と血管新生^5,6,7、8を規制する心筋に有益なパラクリン シグナル。複数の研究は、障害の心外膜形成が心筋^9,10, 血管¹¹及び伝導システム¹²、強調、エッセンシャルで発育障害につながることを実証しています。心の形成に心外膜の貢献。

大人の心、心外膜は休眠層として存在が、それは虚血¹³の時に再開になります。心外膜再ポスト傷害のいくつかを繰り返すプロセス説明にもかかわらず増殖と EMT¹⁴などを含む心臓の開発の小さい効率的に。興味深いことに、正確なメカニズムは十分に理解されていないが修復への貢献を心外膜変更 VEGF-A mRNA¹⁶心の改善の結果、例えば、サイモシン β4¹⁵と治療によって改善できるまたは心筋梗塞後の機能。心外膜は、傷ついた心臓の内因性修復を高めるために興味深い細胞ソースとみなされます。

心臓発生のメカニズムは頻繁に締めくくっているけが、中にあまり効率的な方法ではあるが。心外膜の活性化を求めて、それは決定し、胎児および大人の心外膜の全容量を比較できますは重要です。また、治療の観点から、動物実験だけでなく人間の心外膜の応答に関する知識を拡張、重要です。ここでは、分離し、細胞の培養ひと成人および胎児心外膜派生 (EPDCs) 上皮細胞の形態で、EMT を誘導する手法について述べる。このモデルでは、探索し、成人および胎児の心外膜細胞の挙動を比較を目指します。

このプロトコルの主な利点は、徹底的に検討されていない人間の心外膜材料の使用です。重要なは、説明の分離および細胞培養のプロトコルは、これらの 2 つのセルのソース間の直接比較を有効にする両方の胎児および大人の石畳 EPDCs を取得する単一の統一された方法を提供します。さらに、心外膜は分離の場所に基づいて、セルが実際に epicardially 派生¹⁷であることが保証されます。

人間の追求の分離メソッドが以前に確立されると、大抵伸長プロトコル細胞培養皿^18,19に心臓や心外膜組織の部分をメッキパーツに依存してこれら。このアプローチは、部分的に彼らの上皮性の表現型を失うことが、移行するために、自発的な EMT を受けることになりやすい細胞用により選択します。現在のプロトコルの心外膜は最初の上皮の状態を維持するために分離の EPDCs を可能にする単一細胞液に処理されます。このメソッドは、したがって心外膜 EMT を勉強する固体の in vitroモデルを提供します。

プロトコル

人間の組織標本で実験にはライデン大学医療センター倫理委員会で承認され、ヘルシンキ宣言に準拠しています。細胞文化フロー キャビネットの滅菌装置のすべての手順が実行されます。

1. 準備

1. ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM 低グルコース) と中 199 (M199) を 1:1 の比率で混合することによって追求メディアを準備します。10% 熱不活化ウシ胎児血清 (FBS、56 ° C で 25 分の不活化熱) を追加 100 U/mL ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL を補足します。あらかじめ暖かい EPDC 37 ° C の水浴中。
2. あらかじめトリプシンを暖かい 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C の水浴中。
3. ゼラチンで井戸をコートします。各ウェルに 0.1% ゼラチン/PBS を追加し、37 ° C で少なくとも 15 分版を孵化させなさい必要な細胞培養プレートのためのガイドラインを表 1にまとめます。細胞をメッキする前にすべての流体を慎重に取り外します。
4. ストック溶液 10 mM SB431542 (SB) DMSO (注意) を希釈を準備します。50 μ L の因数は、円錐の底のポリプロピレン製遠心チューブ、エッペン チューブのような-20 ° C で保存SB 因数を一度だけ解凍できることに注意してください。

2. 検索や成人および胎児心臓標本の記憶

1. 15 mL と 50 mL のチューブで手術中に除去に直接人間の大人心耳を保存 10 %fbs、100 U/mL ペニシリンおよび 4 ° C で 100 mg/mL ストレプトマイシンを含む高グルコース DMEMサンプル サイズで 3-5 cm は、一般的に、最大保存することができます郭清後 48 h。
2. 分離後 24 h 最大 4 ° C で EPDC 媒体で人工妊娠中絶材料から得られた胎児の心を格納します。このプロトコルの 12-22 週間の間の妊娠期間でサンプルを使用します。心外膜の隔離のため、心臓全体を使用できることを注意してください。

3. 心外膜層の分離

1. 流キャビネット、PBS の 100 mm 細胞培養皿を準備し、蓋に PBS の独立した液滴 (〜 200 μ L) を配置します。5 mL に予め温めておいた追求中 15 mL チューブを入力します。
2. 場所細胞培養皿にティッシュ PBS でいっぱい。組織はプロシージャの間によく湿らされたことを確認します。
3. 顕微鏡を使用して、多くの削除できるだけ組織サンプルから心外膜層鉗子を使用して剥がして。
   注: 非常に薄い透明なレイヤー (図 1 a) 心臓の外側に密着、心外膜を認識できます。これは分離が阻害されますから心外膜脂肪組織と血管の混入を避けてください。
4. 蓋の上の PBS の液滴の心外膜組織の断片を収集します。
5. メス (図 1 b) を使用してまたは小さな鉗子の先端が鋭いを使用して小さな断片 (0.5 mm³) に心外膜組織を切断します。作品が、P1 を渡すことに注意してください 000 ピペット先端部 (ステップ 3.6)。
6. 心外膜組織にトリプシンの 1 つの mL を追加し、作品と P1, 000 ピペット先端部とトリプシンを収集します。1.5 mL の円錐形遠心管 (図 1) に組織を転送します。
7. 〜 60 rpm で揺れながら 10 分の 37 ° C の水浴のチューブを孵化させなさい。
8. 風呂の水からチューブを外し、70% エタノールで管の外側を清掃します。
9. (図 1) の管の底に沈むし、トリプシンを不活化する 5 mL EPDC 媒体を含んでいる 15 mL チューブに心外膜細胞を含む上清を慎重に転送する組織を許可します。
10. 1 mL のトリプシン、円錐形遠心分離機管の残りのティッシュを補充して上下に軽くピペッティングで混ぜます。
11. 3.7 に 3.10 の手順を 2 回繰り返します。最後のステップでトリプシン培養の 30 分の合計後上澄みと残りの心外膜組織に転送 EPDC 媒体を含んでいる管。
12. 追求中のすべてのセルが収集されると、優しく通過懸濁液 10 mL シリンジ 19 ゲージの針で機械的に細胞 (図 1E) を分離する新しい 15 mL チューブに。
    注: を妨げ得ること針を防ぐために針をソリューションを通過する前に上下にピペッティングによる懸濁液を均一に確認します。
13. さらに細胞を分離するには、21 g 針付き 3.12 手順を繰り返します。
14. 50 mL チューブの上に 100 μ m セル ストレーナーを置き、10 mL のピペットを使用してすべての残りの塊 (図 1 f) を削除するストレーナーに心外膜細胞を含む培地を転送します。
15. こし器に 5 mL EPDC 媒体をピペッティングして残留細胞を収集するストレーナーを洗浄します。
16. 15 mL チューブに 50 mL の管から細胞懸濁液をピペットで移しなさい。以来、細胞はチューブの底に沈む、ピペッティングする前にソリューションを軽く振る。
    注: この手順は必要ではありません、小さい管は遠心分離後、ペレットの可視化を支援します。
17. (図 1) 室温で 5 分間 200 × g で遠心分離機します。
18. 上澄みを除去し、追求中 (表 1) の必要量で (図 1 H) 細胞ペレットを再懸濁します。
    注: 胎児 EPDCs EPDC 培 ALK5 キナーゼ阻害剤 (EPDC + SB) の 10 μ M を直接使用します。大人の細胞は、最初の通過中に SB なしメッキできます。
19. ゼラチン コーティング培養皿 (図 1I) に細胞懸濁液をプレートします。井戸のサイズは、心外膜組織サンプル (表 1) のサイズによって決まります。低密度で EMT の発生を誘発することに注意してください。
20. 37 ° c、5% CO₂細胞培養プレートにアタッチするを許可するように、少なくとも 48 時間のためのインキュベーターにセルを配置します。

4. EPDCs の文化

1. 少なくとも 3 日ごと EPDC + SB 媒体を補充します。
2. 顕微鏡を使用して、少なくとも 3 日間、細胞を検査します。細胞培養プレートが細胞で完全に覆われているとき密度、すなわちに到達、表面比 1:2 のセルを通路します。Confluency に達する 〜 5-10 日を取ることができますに注意してください。
   1. 例えば、ガラス ピペット、ピペットまたは吸引システムを使用してメディアを吸い出しなさい。
   2. PBS をセルに追加することによって、細胞を丁寧に洗います。ゆっくり版は渦巻きし、PBS を吸引します。
   3. プレートにトリプシンを追加します。優しくトリプシン セルはすべてをカバーし、37 ° C で 1 分のプレートをインキュベートするプレートを回転します。
      注意: 可能な限り小さなトリプシンとして使用 (表示: 200 μ L/6 ウェル ウェル プレート)
   4. プレートの底から細胞を機械的に切断するプレートをタップします。顕微鏡を使用して、細胞が切断したかどうかを視覚的に確認します。ない場合は、余分な分インキュベート細胞培養プレート。
   5. セルに追求 + SB 中の必要量を追加、上下、ピペッティングで再懸濁し、細胞懸濁液を新しいゼラチン コーティング培養プレートに転送します。
      注: 一般的には、細胞に保存できます 8 の通路まで石畳形態。

5. EPDCs で EMT の誘導

1. EMT を誘導して、トリプシンと転送新しいゼラチンにセル、4 で説明したように EPDC + SB 中に、表面比 1:2 の井戸をコーティングし、37 ° C、5% CO₂で少なくとも 24 時間インキュベート細胞を分離します。
2. チェック場合合流は 50-70% と EPDCs ある石畳の形態であるかどうかです。
   注: の Confluency EMT を受ける EPDCs の能力に影響します。
3. 細胞から培地を吸引させ、慎重に PBS のセル (4.2.1 - の手順を参照してください 4.2.2)。
4. 1 ng/ml TGFβ3 EPDC 培地で細胞を刺激し、37 ° C、5% CO₂の 5 日間でインキュベーターで配置します。刺激の中に TGFβ3 を含む追求中が持たない補充するに注意してください。
5. セルを毎日監視します。5 日後、EMT を受けた細胞は紡錘形の形態 (図 2 a) によって認識されます。
6. 文化追求中に SB の TGFβ 添加せず 4 で説明されている方法に従って紡錘形 EPDCs。一般に、紡錘形 EPDCs 注は、20 の通路まで培養することができます。
7. 免疫蛍光染色と EMT の発生を検証ファロイジン、間葉系のマーカー αSMA またはビメンチンに対する抗体を使用して F-アクチン繊維の応力 (図 2 b) の形成を検出するまたは EMT 関連遺伝子 (の qRT PCR を使用して例えば、WT1, ペリオスチン Col1A1、αSMA、N-カドヘリン、MMP3、カタツムリ、ナメクジ) (図 2および表 2)。

結果

ここでは、我々 は人間成人および胎児心臓組織 (図 1) から EPDCs を分離するための単純なプロトコルを概説します。(図 1 a) 心臓の外側の心外膜の容易にアクセス可能な場所のこのプロトコルを活用します。心耳垂染色後郭清基になる下の細胞外マトリックスと心筋組織のままそのまま (図 1 j) WT1 + 心?...

ディスカッション

ここで人間の成人および胎児心に由来する一次心外膜細胞を分離するための詳しいプロトコル文化について述べる。これらの細胞の広範な評価は、以前に公開された¹⁷をされています。我々 は両方のセルタイプを ALK5 キナーゼ阻害剤 SB431542 による培養上皮の石畳のような細胞として維持できることを示しています。EMT は開発およびポスト傷害応答中に体内の心外膜?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083