El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

Resumen

El epicardio desempeña un papel crucial en el desarrollo y la reparación del corazón células y factores de crecimiento para la pared miocardio. Aquí, describimos un método para las células epicárdicas primaria humanas cultura que permite el estudio y comparación de sus características de desarrollo y adultos.

Resumen

El epicardio, un capa de células epiteliales que cubre el miocardio, tiene un papel fundamental durante el desarrollo cardíaco, así como en la respuesta de reparación del corazón después de lesión isquémica. Cuando se activa, las células epicárdicas se someten a un proceso conocido como epitelial de transición mesenquimal (EMT) para proporcionar a las células para regenerar miocardio. Además, el epicardio contribuye mediante la secreción de factores paracrinos esencial. Para apreciar el potencial regenerativo del epicardio, se requiere un modelo de célula humana. Aquí esbozamos un modelo de cultura de célula novela para derivar las células derivadas epicárdicas primarias (EPDCs) del tejido cardiaco adulto y fetal humano. Para aislar EPDCs, el epicardio es disecado desde el exterior de la pieza de corazón y transformar en una suspensión unicelular. A continuación, EPDCs son plateados y cultivadas en medio de la CDEP que contiene el inhibidor de la 5-quinasa ALK SB431542 mantener su fenotipo epitelial. EMT es inducida por la estimulación con TGFβ. Este método permite, por primera vez, el estudio del proceso de EMT epicárdico humano en un ambiente controlado y facilita el obtener una visión más clara en el secretoma de EPDCs que puede ayudar a la regeneración del corazón. Además, este enfoque uniforme permite la comparación directa de la conducta humana adulta y fetal epicárdico.

Introducción

El epicardio, un capa epitelial unicelular que sobres el corazón, es de vital importancia para el desarrollo cardíaco y reparación (revisado en Smits et al. ¹). retraso mental, el epicardio deriva el órgano proepicárdicas, una pequeña estructura situada en la base del corazón en desarrollo. Desarrollo día E9.5 en Concepción después de 4 semanas en ser humano y el ratón, las células comienzan a migrar desde esta estructura de coliflor y cubrir el desarrollo del miocardio². Una vez que se forma una capa única de células epiteliales, una porción de las células epicárdicas sufre epitelial de transición mesenquimal (EMT). Durante la EMT, las células pierden sus características epiteliales, tales como adhesiones célula-célula y obtención un fenotipo mesenquimal que les da la capacidad de migrar en el miocardio en vías de desarrollo. Las células derivadas epicárdicas formadas (EPDCs) pueden distinguir en varios tipos de células cardiacas incluyendo fibroblastos, células musculares lisas y potencialmente cardiomiocitos y células endoteliales³, aunque la diferenciación de estos últimos dos celulares las poblaciones sigue siendo objeto de debate (revisado en Smits et al. ⁴). Además, el epicardio proporciona señales instructivas paracrina al miocardio para regular su crecimiento y vascularización^5,6,7,8. Múltiples estudios han demostrado que formación epicárdica deteriorada conduce a defectos de desarrollo en músculo cardiaco^9,10, vasculatura¹¹y conducción sistema¹², haciendo hincapié en lo esencial contribución de epicardio a la formación del corazón.

Aunque el epicardio está presente como una capa inactiva en el corazón adulto, se llega a ser reactivado a isquemia¹³. Después de la lesión epicárdica reactivación recapitulan varios de los procesos describen para el desarrollo cardíaco, incluyendo proliferación y¹⁴de la EMT, aunque menos eficientemente. Curiosamente, aunque el mecanismo exacto no se entiende completamente, la contribución epicárdica a reparar se puede mejorar mediante tratamiento con, por ejemplo, timosina β4¹⁵ o modificado ARNm del VEGF-A¹⁶, dando por resultado cardiaco mejoró función después de infarto de miocardio. El epicardio, por tanto, se considera una fuente interesante de celular para mejorar la reparación endógena del corazón lesionado.

Mecanismos del desarrollo cardíaco a menudo son recapitulados durante la lesión, aunque de manera menos eficiente. En busca de activadores epicárdicos, es de suma importancia que podemos determinar y comparar la capacidad total de epicardio fetal y adulto. Por otra parte, desde un punto de vista terapéutico, es importante que, además de los experimentos con animales, ampliamos conocimientos sobre la respuesta del epicardio humana. Aquí, describimos un método para aislar y adulto y fetales epicárdicas derivado las células humanas (EPDCs) en una morfología epitelial-célula-como de la cultura y para inducir la EMT. Con este modelo, nuestro objetivo es explorar y comparar el comportamiento adulto y fetal la célula epicárdico.

La principal ventaja de este protocolo es el uso de material epicárdico humano, que no ha sido bien estudiado. Lo importante, el protocolo de cultivo aislamiento y celular descrito proporciona un método uniforme para derivar ambos EPDCs adoquín fetal y adulto, lo que permite una comparación directa entre estas fuentes de dos células. Además, desde el epicardio está aislado basado en su ubicación, se asegura que las células son realmente epicardially derivada¹⁷.

Mientras que previamente se han establecido métodos de aislamiento de DAPC humanos, estos en su mayoría dependen de protocolos de derivación donde se platean pedazos de tejido cardiaco o epicárdico en una célula cultura plato^18,19. Este enfoque lo selecciona específicamente por células que pierden parcialmente su fenotipo epitelial para migrar, y que son más propensos a experimentar la EMT espontánea. En el protocolo actual, el epicardio se transforma primero en una solución única célula que permite el EPDCs aislados mantener su estado epitelial. Este método por lo tanto proporciona un modelo sólido en vitro para estudiar la EMT epicárdico.

Protocolo

Todos los experimentos con muestras de tejido humano fueron aprobados por el Comité de ética de la Leiden University Medical Center y se ajusta a la declaración de Helsinki. Todas las medidas se realizan con equipo estéril en un flujo de la cultura de célula gabinete.

1. preparaciones

1. Preparar medio de DAPC mezcla de Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM low-glucosa) y medio 199 (M199) en una proporción 1:1. Agregar 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS, calor inactivada durante 25 minutos a 56 ° C) y completar con 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL. Caliente previamente el medio de DAPC en un baño de agua de 37 ° C.
2. Caliente previamente la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) en un baño de agua de 37 ° C.
3. Pozos de la capa con la gelatina. Añadir 0.1% gelatina/PBS a cada pocillo e incubar las placas durante al menos 15 min a 37 ° C. Directrices para la placa de cultivo celular requiere se resumen en la tabla 1. Retire con cuidado todo el líquido antes de las células de la galjanoplastia.
4. Preparar una solución stock de 10 mM SB431542 (SB), diluida en DMSO (PRECAUCIÓN). 50 alícuotas de μL en tubos de centrífuga de polipropileno de fondo cónico, como tubos de Eppendorf y almacenar a-20 ° C. Nota que alícuotas SB pueden ser descongelados una sola vez.

2. recuperación y almacenamiento de las muestras del corazón Fetal y adulto

1. Tienda humanas aurículas adultos directamente en la remoción durante la cirugía en un tubo de 50 mL con 15 mL alta glucosa DMEM con 10% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. Las muestras son generalmente 3-5 cm de tamaño y se pueden almacenar hasta 48 h después de la disección.
2. Guarde el corazón fetal obtenidos de material de aborto en medio de la CDEP a 4 ° C hasta 24 horas después de aislamiento. De este protocolo, utilizar muestras con una edad gestacional entre las semanas 12-22. Tenga en cuenta que el corazón entero se puede utilizar para el aislamiento del epicardio.

3. aislamiento de la capa epicárdica

1. En el gabinete de flujo laminar, preparar un plato de cultivo celular de 100 mm con PBS y coloque una gota de separado (~ 200 μL) de PBS en la tapa. Llene un tubo de 15 mL con medio de DAPC precalentado 5 mL.
2. Coloque el tejido en el plato de cultivo de células con PBS. Asegúrese de que el tejido se humedece frecuentemente durante el procedimiento.
3. Mediante un estereomicroscopio, quitar tanto de la capa epicárdica de la muestra de tejido como sea posible por pelar apagado con unas pinzas.
   Nota: El epicardio puede reconocerse como una capa muy fina, transparente firmemente adherido al exterior del corazón (figura 1A). Trate de evitar la contaminación con tejido adiposo epicárdico y los vasos sanguíneos ya que esto obstaculizará el aislamiento.
4. Recoge piezas de tejido epicárdico en la gota de PBS en la tapa.
5. Cortar el tejido epicárdico en trozos pequeños (0.5 mm³) usando un bisturí (figura 1B), o usando las afiladas puntas de pinzas pequeñas. Tenga en cuenta que las piezas puedan pasar un P1, 000 punta de la pipeta (paso 3.6).
6. Añadir 1 mL de tripsina en el tejido epicárdico y recoger los pedazos y tripsina con un P1, 000 punta de la pipeta. Transferir el tejido en un tubo de centrífuga cónico de 1,5 mL (figura 1).
7. Incubar el tubo en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min, agitando a ~ 60 rpm.
8. Retire el tubo del baño y limpie el exterior del tubo con etanol al 70%.
9. Permitir que el tejido se hunden hasta el fondo del tubo (figura 1) y transferir cuidadosamente el sobrenadante que contiene las células epicárdicas al tubo de 15 mL que contiene 5 mL medio de DAPC para inactivar la tripsina.
10. Reponer el tejido restante en el tubo de centrífuga cónico con tripsina 1 mL y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
11. Repita el paso 3.7 a 3.10 dos veces. En la etapa final, después de un total de 30 min de incubación de la tripsina, transferir el sobrenadante y el restante tejido epicárdico en el tubo que contiene medio de DAPC.
12. Cuando todas las células se recogen en medio de la CDEP, suavemente pasar la suspensión a través de una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 19 a un nuevo tubo de 15 mL a disociar mecánicamente las células (Figura 1E).
    Nota: Asegúrese de homogeneizar la suspensión mediante pipeteo arriba y abajo antes de pasar la solución a través de la aguja para evitar que la aguja que obstruye.
13. Para más disociar las células, repita el paso 3.12 con una aguja de calibre 21.
14. Coloque un colador celular de 100 μm en la parte superior un tubo de 50 mL y transferir el medio que contiene las células epicárdicas en el filtro con una pipeta de 10 mL para eliminar los grupos restantes (Figura 1F).
15. Lave el filtro para recoger células residuales mediante pipeteo medio de DAPC 5 mL en el colador.
16. Pipetear la suspensión de la célula del tubo 50 mL en un tubo de 15 mL. Puesto que las células se hunden hasta el fondo del tubo, agite suavemente la solución antes de pipetear.
    Nota: Aunque este paso no es necesario, un tubo más pequeño ayuda a la visualización de la pelotilla después de la centrifugación.
17. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente (figura 1).
18. Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células (figura 1 H) en el volumen requerido de medio CDEP (tabla 1).
    Nota: Para EPDCs fetales, utilizar directamente medio DAPC conteniendo 10 μm ALK5 kinase del inhibidor de la (DAPC + SB). Las células adultas se pueden platear sin SB durante el primer paso.
19. Placa de la suspensión de células en las placas recubierta de gelatina (figura 1I). El tamaño del pozo depende del tamaño de la muestra de tejido epicárdico (tabla 1). Nota que confluencia baja induce la ocurrencia de la EMT.
20. Colocar las células en la incubadora durante al menos 48 h a 37 ° C, 5% CO₂ para permitir que las células fijar a la placa de cultivo.

4. cultura de EPDCs

1. Reponer el medio DAPC + SB al menos cada 3 días.
2. Inspeccione las celdas por lo menos cada 3 días con el microscopio. Cuando las células alcanzan confluencia, es decir, cuando la placa de cultivo se cubre totalmente con las células, las células en una proporción de 1:2 superficie del paso. Tenga en cuenta que llegar a confluencia puede tomar ~ 5-10 días.
   1. Aspire el medio con una pipeta o un sistema de aspiración, por ejemplo, una pipeta de vidrio.
   2. Lave cuidadosamente las células mediante la adición de PBS a las células. Suavemente la placa del remolino y aspirar el PBS.
   3. Añadir tripsina a la placa. Gire suavemente la placa para cubrir todas las celdas con tripsina e Incube la placa durante 1 min a 37 ° C.
      Nota: Utilizar como tripsina poco como sea posible (indicación: 200 μL por pozo de 6 bien la placa)
   4. Toque en la placa para separar mecánicamente las células de la parte inferior de la placa. Utilizar el microscopio para comprobar visualmente si las células han separado. Si no, incubar la placa de cultivo celular por un minuto.
   5. Añadir el volumen necesario de medio DAPC + SB a las células, suspender mediante pipeteo arriba y abajo y transferir la suspensión a una placa de cultivo gelatina cubierta nueva.
      Nota: en general, las células pueden tener una morfología de adoquines hasta el paso 8.

5. inducción de la EMT en EPDCs

1. Para inducir la EMT, disociar las células con tripsina y transferencia de las células a la nueva gelatina cubierto de pozos en una proporción de superficie de 1:2 en medio de la CDEP + SB, como se describe en 4 e incuban durante al menos 24 h a 37 ° C, 5% CO₂.
2. Compruebe si confluency es 50-70% y si EPDCs tienen una morfología de adoquines.
   Nota: Confluencia afecta la capacidad de EPDCs a EMT.
3. Aspirar el medio de las células y lavar las células con PBS (vea el paso 4.2.1 - 4.2.2).
4. Estimular las células con 1 ng/mL TGFβ3 en medio DAPC y colocarlos en una incubadora a 37 ° C, 5% CO₂ durante 5 días. Tenga en cuenta que durante la estimulación, el medio de DAPC con TGFβ3 no tiene que ser reemplazados.
5. Monitorear diariamente las células. Después de 5 días, las células que experimentaron la EMT son reconocidas por una morfología en forma de huso (figura 2A).
6. Cultura en forma de huso EPDCs según el método descrito en 4 sin adición de SB o TGFβ al medio de DAPC. Tenga en cuenta que en general, fusiformes EPDCs puede cultivarse hasta el paso 20.
7. Validar la ocurrencia de la EMT con la tinción de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos contra la vimentina marcadores mesenquimales αSMA o phalloidin para detectar la formación de fibras de estrés de F-actina (figura 2B), o uso de qRT-PCR para genes relacionados con la EMT ( por ejemplo,, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Caderina, MMP3, Snail, Slug) (figura 2 y tabla 2).

Resultados

Aquí, describimos un protocolo sencillo para aislar EPDCs de tejido humano adulto y fetal cardiaco (figura 1). Este protocolo aprovecha la ubicación fácilmente accesible del epicardio en la parte exterior del corazón (figura 1A). La coloración de la aurícula del corazón después de disección demuestra que el WT1 + epicardio se retira mientras que la subyacente subepicárdico matriz extracelular y tejido miocárdico perman...

Discusión

Aquí describimos un protocolo detallado para aislar y la cultura primarias epicárdicas células derivadas de los corazones humanos adultos y fetales. Amplia caracterización de estas células ha sido previamente publicado¹⁷. Hemos demostrado que se pueden mantener ambos tipos de células como las células epiteliales de adoquines-como cuando se cultivan con el inhibidor de la cinasa del ALK5 SB431542. EMT es una parte integral de activación epicárdica en vivo durante el desarrollo y l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083