Изоляции и культуры клеток первичного эпикардиальной, производный от сердца человека взрослых и плода образцов

Резюме

Epicardium играет решающую роль в развитии и ремонт сердца, предоставляя клетки и факторы роста к стенке миокарда. Здесь мы описываем метод культуры клеток человека первичной эпикардиальной который позволяет исследование и сравнение характеристик их развития и взрослых.

Аннотация

Epicardium, слой эпителиальных клеток, охватывающих миокарда, играет важную роль во время развития сердца, а также в ответе ремонт сердца после ишемического повреждения. При активации, эпикардиальной клетки претерпевают процесс, известный как эпителиального мезенхимальных перехода (EMT) предоставлять клеток к регенерации миокарда. Кроме того epicardium вносит через секреции основных паракринными факторов. В полной мере оценить регенеративный потенциал epicardium, требуется модель клеток человека. Здесь мы приводим романа ячеечная модель культуры для получения первичных клеток эпикардиальной производных (EPDCs) от человека взрослых и плода сердечной ткани. Чтобы изолировать EPDCs, epicardium расчлененный извне сердце образца и перерабатывается в одну ячейку подвеска. Далее EPDCs покрытием и культивировали в EPDC среде, содержащей ALK ингибитор 5-киназы SB431542 для поддержания их эпителиального фенотип. EMT индуцируется стимуляции с TGFβ. Этот метод позволяет, в первый раз, изучение процесса человеческого эпикардиальной EMT в контролируемых условиях и облегчает набирает больше проницательности в secretome EPDCs, которые могут помочь регенерации сердца. Кроме того этот единообразный подход позволяет для прямого сравнения эпикардиальной поведения человека взрослых и плода.

Введение

Epicardium, эпителиального пласта одной ячейки, что конверты сердца, имеет жизненно важное значение для развития сердечной и ремонт (обзор в Смитс et al. ¹). вследствие порока развития, epicardium возникает от proepicardial орган, маленькая структура, расположенный на базе развивающихся сердца. Вокруг развития день E9.5 в мыши и 4 недели после зачатия в человека клетки начинают мигрировать из этой структуры цветная капуста и охватывают развивающихся миокарда². Как только на одной эпителиальных клеток образуется слой, часть эпикардиальной клеток проходит эпителиальных мезенхимальных перехода (EMT). В ходе EMT клетки теряют их эпителиального характеристики, такие как ячеек спайки и получить мезенхимальных фенотип, который дает им способность мигрировать в развивающихся миокарда. Сформированные эпикардиальной производных клетки (EPDCs) могут дифференцироваться в нескольких типов сердечных клеток, включая фибробласты, клетки гладких мышц и потенциально кардиомиоцитов и эндотелиальных клеток³, хотя дифференциация последних двух ячеек населения остается предметом обсуждения (обзор в Смитс и др. ⁴). Кроме того, epicardium обеспечивает поучительным паракринными сигналы в миокарде регулировать ее роста и васкуляризация^5,6,,78. Многочисленные исследования показали, что нарушение эпикардиальной формирования приводит к пороков в сердечной мышцы^9,10, сосудистую¹¹и проведение системы¹², подчеркивая основные вклад epicardium к формированию сердца.

Хотя в самом взрослых epicardium присутствует как спящие слой, он становится возобновлена после ишемии¹³. После травмы эпикардиальной реактивации резюмирует некоторые из процессов описал для сердца развития, включая распространение и EMT¹⁴, хотя и менее эффективно. Интересно хотя точный механизм не поняты, эпикардиальной вклад ремонт может быть улучшена путем обращения с, например, Thymosin β4¹⁵ или изменение VEGF-А мРНК¹⁶, что приводит к улучшенное сердечной функция, после инфаркта миокарда. Epicardium поэтому считается интересный источник клеток для повышения внутреннего ремонта потерпевшего сердца.

Механизмы развития сердца часто изъятый во время травмы, хотя и в менее эффективным способом. Поисках эпикардиальной активаторы важно, что мы можем определить и сравнить на полную мощность плода и взрослых epicardium. Кроме того с терапевтической точки зрения, важно, что, помимо экспериментов на животных, мы расширить знания относительно реакции человеческого epicardium. Здесь мы описываем метод, чтобы изолировать и культуры взрослых и плода эпикардиальной производных клетки человека (EPDCs) в морфологии как эпителиальных клеток и побудить EMT. С этой моделью мы стремимся изучить и сравнить поведение взрослых и плода эпикардиальной клеток.

Основным преимуществом этого протокола является использование эпикардиальной материала человека, который не были тщательно изучены. Важно отметить, что описанные изоляции и клетки культуры протокол обеспечивает один единый метод для получения обоих EPDCs плода и взрослых булыжником, позволяя прямое сравнение между этими двумя клетки источниками. Кроме того поскольку epicardium изолирован, основанный на ее расположении, обеспечивается что клетки являются на самом деле epicardially производных¹⁷.

В то время как человека методы изоляции EPDC были созданы ранее, эти основном полагаются на протоколы нарост, где кусочки ткани, сердца или эпикардиальной покрыты на клетки культуры блюдо^18,19. Этот подход таким образом выбирает специально для клетки, частично теряют их эпителиального фенотипом для миграции, и что более подвержены проходят самопроизвольно EMT. В текущем протоколе epicardium сначала обрабатывается в одну ячейку решение, которое позволяет изолированных EPDCs для поддержания их эпителия. Таким образом, этот метод обеспечивает твердых в vitro модель для изучения эпикардиальной EMT.

протокол

Все эксперименты с образцами тканей человека были утверждены Комитетом по этике медицинский центр Университета Лейдена и соответствует Хельсинкской декларации. Все действия выполняются с стерильных оборудования в потоке культуры клеток кабинета.

1. Подготовка

1. Подготовка среднего EPDC, смешивая Дульбекко изменение орла среднего (DMEM низким глюкозы) и среда 199 (M199) в соотношении 1:1. Добавить 10% тепла инактивированная плода бычьим сывороточным (ФБС, тепла, инактивированная 25 мин на 56 ° C) и дополнить с 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл. Предварительно теплой среде EPDC в ванну воды 37 ° C.
2. Предварительно теплой трипсина 0.25%/EDTA в ванну воды 37 ° C (1:1).
3. Герб скважин с желатином. Добавить 0,1% желатина/PBS в каждой скважине и инкубировать пластины для по крайней мере 15 минут при 37 ° C. В таблице 1кратко излагаются руководящие принципы для плиты культуры необходимые ячейки. Осторожно удалите все жидкости до гальванических клеток.
4. Подготовьте раствор 10 мм SB431542 (SB), разбавляют в ДМСО (осторожно). Сделать 50 мкл аликвоты в полипропиленовые пробирок коническое дно, как Eppendorf трубы и хранить их при-20 ° C. Обратите внимание, что SB аликвоты можно разморозить только один раз.

2. получение и хранение образцов взрослых и плода сердца

1. Хранить человека взрослых ушных раковин непосредственно после удаления во время операции в 50-мл пробирку с 15 мл DMEM высокой глюкозы, содержащие 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мг/мл при 4 ° C. Образцы, как правило, 3-5 см в размерах и может храниться до 48 часов после вскрытия.
2. Храните сердца плода, полученные из факультативных аборта материала в EPDC среде при температуре 4 ° C до 24 ч после изоляции. Для этого протокола используйте образцы с гестационного возраста между 12-22 недель. Обратите внимание, что всем сердцем может использоваться для изоляции epicardium.

3. изоляция эпикардиальной слоя

1. В Шкаф ламинарный поток подготовить 100-мм клеток культуры блюдо с PBS и место отдельные капли (~ 200 мкл) PBS в крышке. Заполните 15 мл с подогретым среднего EPDC 5 мл.
2. Место ткани в культуре клеток блюдо, заполнены с PBS. Убедитесь, что ткань смачивают часто во время процедуры.
3. С помощью стереомикроскопом, удалите столько эпикардиальной слоя из образца ткани как можно скорее, слезать с помощью щипцов.
   Примечание: Epicardium может быть признано как очень тонкий, прозрачный слой жестко придерживаться вне сердца (рис. 1A). Старайтесь избегать загрязнения с эпикардиальной жировой ткани и кровеносных сосудов, поскольку это будет препятствовать изоляции.
4. Соберите кусочки эпикардиальной ткани в капли PBS на крышке.
5. Вырежьте эпикардиальной ткани на мелкие кусочки (³0,5 мм) с помощью скальпеля (рис. 1B) или острый советы малых щипцами. Обратите внимание, что части должны быть в состоянии пройти P1, 000 наконечник пипетки (шаг 3,6).
6. Добавьте 1 mL трипсина эпикардиальной ткани и собирать куски и трипсина с P1, 000 наконечник пипетки. Передача ткани в 1,5 мл конические центрифуги трубку (рис. 1 c).
7. Инкубируйте трубку в водяной бане 10 минут, 37 ° C при встряхивании в ~ 60 об/мин.
8. Снять трубку из водяной бани и Очистите наружную трубу с 70% этиловом спирте.
9. Разрешить ткани опускаться на дно трубки (рис. 1 d) и тщательно передачи супернатанта, содержащий эпикардиальной клетки для 15-мл пробирку, содержащую 5 мл EPDC среднего для инактивации трипсина.
10. Пополнять оставшиеся ткани в конической пластиковых пробирок с 1 мл трипсина и смешайте нежно закупорить вверх и вниз.
11. Повторите шаг 3.7 в 3.10 два раза. На заключительном этапе после всего 30 минут инкубации трипсина, передача супернатант и оставшиеся эпикардиальной ткани в пробирку, содержащую среднего EPDC.
12. Когда все клетки собраны в EPDC среде, мягко пройти подвеска через шприц 10 мл с 19-иглы в новой 15-мл пробирку для механически отделить клетки (Рисунок 1E).
    Примечание: Не забудьте гомогенизировать подвеска, закупорить вверх и вниз перед передачей решение через иглу, чтобы предотвратить получение помешано иглы.
13. Для дальнейшего отмежеваться клетки, повторите шаг 3.12 с иглой 21-го калибра.
14. Место стрейнер ячейки 100 мкм на вершине 50 мл и передаче носитель, содержащий эпикардиальной клетки на сито с помощью пипетки 10-мл, чтобы удалить все оставшиеся сгустки (Рисунок 1F).
15. Промойте фильтр для сбора остаточной клетки, закупорить среднего EPDC 5 мл на сито.
16. Накапайте суспензии клеток с 50 мл трубки в 15 мл. Поскольку клетки опускаться на дно трубки, осторожно встряхните решение перед закупорить.
    Примечание: Хотя этот шаг не является необходимым, трубу меньшего средства визуализации гранул после центрифугирования.
17. Центрифуга на 200 x g 5 мин при комнатной температуре (рис. 1 g).
18. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток (рис. 1 H) в необходимый объем EPDC среды (Таблица 1).
    Примечание: Для плода EPDCs, непосредственно используйте EPDC носитель, содержащий 10 мкм ингибитора киназы ALK5 (EPDC + SB). Взрослые клетки может быть покрытием без SB во время первого прохода.
19. Пластина суспензию клеток на желатин покрытием культуры пластины (рис. 1I). Размер также зависит от размера образца эпикардиальной ткани (Таблица 1). Обратите внимание, что низкая confluency вызовет возникновение EMT.
20. Место клетки в инкубаторе для по крайней мере 48 ч при 37 ° C, 5% CO₂ разрешить клетки, чтобы прикрепить к пластине культуры.

4. Культура EPDCs

1. Пополнение EPDC + SB среднего по крайней мере каждые 3 дня.
2. Проверьте ячейки по крайней мере каждые 3 дня, используя микроскоп. Когда клетки confluency, то есть, когда пластина культуры полностью покрыты клетки, проход клетки в соотношении 1:2 поверхности. Обратите внимание, что достигнув confluency можно взять ~ 5-10 дней.
   1. Аспирационная средство, с помощью пипетки или системы аспирации, например, стеклянные пипетки.
   2. Тщательно вымойте клетки путем добавления PBS в клетки. Аккуратно водоворот пластину и аспирационная PBS.
   3. Добавление трипсина к пластине. Осторожно поверните пластину для покрытия всех клеток с трипсина и инкубировать пластину за 1 мин при температуре 37 ° C.
      Примечание: Использовать как мало трипсина максимально (индикация: 200 мкл на хорошо 6 хорошо пластины)
   4. Нажмите пластины механически отделить клетки из нижней части пластины. Используйте Микроскоп визуально проверить, если отдельные клетки. Если нет, то инкубации пластину культуры клеток для дополнительных минут.
   5. Добавьте необходимый объем EPDC + SB среднего клетки, Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз и передачи суспензию клеток к новой плите культуры желатин покрытием.
      Примечание: В общем, клетки могут храниться в морфологии булыжник до прохода 8.

5. индукция EMT в EPDCs

1. Чтобы побудить EMT, разбить ячейки с трипсина и передачи клетки к новым желатин покрытием скважин в соотношении 1:2 поверхности в среде EPDC + SB, как описано в 4 и инкубировать в течение 24 часов при 37 ° C, 5% CO₂.
2. Проверка если confluency является 50-70% и если EPDCs булыжником морфологии.
   Примечание: Confluency влияет на способность EPDCs пройти EMT.
3. Аспирационная среднего из клеток и вымыть клетки тщательно с PBS (см. шаг 4.2.1 - 4.2.2).
4. Стимулируют клетки с 1 нг/мл TGFβ3 в EPDC среде и поместите их в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO₂ на 5 дней. Обратите внимание, что во время стимуляции, среднего EPDC, содержащих TGFβ3 не должны быть пополнен.
5. Ежедневно контролировать клетки. После 5 дней клетки, которые прошли EMT распознаются веретеновидной формы морфологии (рис. 2A).
6. Культура веретеновидной формы EPDCs по методу, описанному в 4 без добавления SB или TGFβ в EPDC среде. Обратите внимание, что в целом, веретеновидной формы EPDCs может быть культивировали до прохода 20.
7. Проверка вхождения ЕМТ с immunofluorescent окрашивание с помощью антител против αSMA мезенхимы маркеры или виментин или Фаллоидин обнаружить формирования F-актина стресс волокон (рис. 2B), или qRT ПЦР для ЕМТ связанных генов ( например, РК1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Кадгерины, MMP3, Улитка, слизень) (рис. 2 c и Таблица 2).

Результаты

Здесь мы приводим простой протокол для изоляции EPDCs от человека взрослых и плода сердечной ткани (рис. 1). Этот протокол использует легко доступном месте epicardium на внешней стороне сердца (рис. 1A). Пятнать ушных раковин сердца после рассечен...

Обсуждение

Здесь мы описываем подробный протокол для изоляции и культуры первичной эпикардиальной клетки, полученные от человеческих сердцах взрослых и плода. Обширные характеристики этих клеток был ранее опубликованный¹⁷. Мы показали, что оба типы клеток можно сохранить как клетки ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083