O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

Resumo

O epicárdio desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na reparação do coração, fornecendo células e fatores de crescimento da parede miocárdica. Aqui, descrevemos um método de cultura primária Epicárdica células de origem humana que permite o estudo e a comparação de suas características de adultas e de desenvolvimento.

Resumo

O epicárdio, uma camada de células epiteliais, cobrindo o miocárdio, tem um papel essencial durante o desenvolvimento cardíaco, bem como na resposta de reparação do coração após lesão isquêmica. Quando ativado, Epicárdica células passam por um processo conhecido como epiteliais de transição mesenquimal (EMT) para fornecer células para a regeneração do miocárdio. Além disso, o epicárdio contribui através da secreção de fatores essenciais parácrina. Para apreciar plenamente o potencial regenerativo do epicárdio, um modelo de célula humana é necessário. Aqui podemos delinear um modelo de cultura celular novela para derivar células derivadas Epicárdica primárias (EPDCs) de tecido cardíaco humano adulto e fetal. Para isolar EPDCs, o epicárdio é dissecado do lado de fora do espécime coração e transformado em uma suspensão de célula única. Em seguida, EPDCs são chapeados e cultivadas em meio de EPDC contendo o inibidor da 5-quinase ALK SB431542 para manter seu fenótipo epitelial. EMT é induzida pela estimulação com TGFβ. Este método permite, pela primeira vez, o estudo do processo de EMT Epicárdica humana em um ambiente controlado e facilita a ganhar mais conhecimento no secretome de EPDCs que pode ajudar na regeneração do coração. Além disso, esta abordagem uniforme permite a comparação direta do comportamento humano adulto e fetal Epicárdica.

Introdução

O epicárdio, uma camada epitelial de célula única que envelopes o coração, é de vital importância para o desenvolvimento cardíaco e reparação (revisto em Smits et al ¹). desenvolvente, epicárdio surge a partir do órgão de proepicardial, uma pequena estrutura localizada na base do coração em desenvolvimento. Em torno do desenvolvimento dia E9.5 no rato e 4 semanas pós-concepção em humanos, células começam a migrar a partir desta estrutura de couve-flor e cubra o desenvolvimento do miocárdio². Uma vez que é formada uma camada única de células epiteliais, uma parte das células Epicárdica sofre epitelial de transição mesenquimal (EMT). Durante EMT, células perdem suas características epiteliais, tais como aderências célula-célula e obter um fenótipo mesenquimal que lhes dá a capacidade de migrar para o miocárdio em desenvolvimento. As células derivadas Epicárdica formadas (EPDCs) podem se diferenciar em vários tipos de células cardíacas, incluindo fibroblastos, células musculares lisas e potencialmente cardiomyocytes e células endoteliais³, embora a diferenciação destes últimos dois celular as populações continua a ser objecto de debate (revisto em Smits et al ⁴). Além disso, o epicárdio fornece sinais de parácrina instrutivo para o miocárdio para regular o seu crescimento e vascularização^5,6,7,8. Vários estudos têm demonstrado que a deficiente formação Epicárdica leva a defeitos no desenvolvimento de músculo cardíaco^9,10, vasculatura¹¹e condução sistema¹², enfatizando o essencial contribuição do epicárdio para a formação do coração.

Embora no coração adulto epicárdio está presente como uma camada de dormente, ele torna-se reativado após isquemia¹³. Pós-lesão Epicárdica reativação recapitula a vários dos processos descritos para desenvolvimento cardíaco, incluindo proliferação e EMT¹⁴, embora menos eficientemente. Curiosamente, embora o mecanismo exato não é totalmente compreendido, a contribuição Epicárdica para reparar pode ser melhorada por tratamento com, por exemplo, Timosina β4¹⁵ ou modificado de RNAm de VEGF-A¹⁶, resultando em cardíaco melhorou função após infarto do miocárdio. O epicárdio, portanto, é considerado uma interessante fonte de célula para realçar reparar endógena do coração ferido.

Mecanismos de desenvolvimento cardíaco são frequentemente instaurados durante a lesão, embora de forma menos eficiente. Em busca de ativadores epicárdica, é primordial que podemos determinar e comparar a capacidade total do epicárdio fetal e adulto. Além disso, do ponto de vista terapêutico, é importante que, além de experiências com animais, estendemos conhecimentos sobre a resposta do epicárdio humana. Aqui, descrevemos um método para isolar e cultura adultas e fetais Epicárdica derivadas células humanas (EPDCs) em uma célula epitelial--como morfologia e induzir EMT. Com este modelo, pretendemos explorar e comparar o comportamento de célula Epicárdica adulto e fetal.

A principal vantagem deste protocolo é o uso de material humano epicárdico, que não tem sido exaustivamente estudado. Importante, o protocolo de cultura de isolamento e celular descrito fornece um único método uniforme para derivar Ambos EPDCs godo fetal e adulto, permitindo uma comparação direta entre essas fontes de duas células. Além disso, desde que o epicárdio é isolado com base em sua localização, assegura-se que as células são na verdade epicardially derivada de¹⁷.

Embora métodos de isolamento humanos EPDC tenham sido criados anteriormente, estas principalmente dependem de protocolos de consequência natural, onde os pedaços de tecido cardíaco ou epicárdico são banhados em uma cela cultura prato^18,19. Esta abordagem desse modo seleciona especificamente para as células que parcialmente perder seu fenótipo epitelial para migrar, e que são mais propensas a se submeter a EMT espontânea. No protocolo atual, o epicárdio é primeiro transformado em uma solução única célula que permite as EPDCs isolados manter seu estado epitelial. Este método fornece, portanto, um modelo sólido em vitro para estudar Epicárdica EMT.

Protocolo

Todos os experimentos com amostras de tecido humano foram aprovados pelo Comitê de ética do centro médico da Universidade de Leiden e está em conformidade com a declaração de Helsinque. Todas as etapas são executadas com equipamentos esterilizados em um fluxo de cultura de células do armário.

1. preparações

1. Prepare o suporte de EPDC pela mistura de Dulbecco médio da águia modificado (DMEM baixa-glicose) e meio 199 (M199) em uma proporção de 1:1. Adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS, calor inativado por 25 min a 56 ° C) e completar com 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL. Pré-aquecer o meio EPDC em banho maria a 37 ° C.
2. Pré-aquecer a tripsina 0.25%/EDTA (1:1) em banho maria a 37 ° C.
3. Revestimento de poços com gelatina. Adicione 0,1% gelatina/PBS a cada poço e incubar as placas durante pelo menos 15 minutos a 37 ° C. Diretrizes para a placa de cultura de células necessárias estão resumidas na tabela 1. Cuidadosamente retire todo fluido antes de chapear pilhas.
4. Prepare uma solução stock de 10 mM SB431542 (SB), diluída em DMSO (cuidado). Faça 50 alíquotas µ l em tubos de centrífuga de polipropileno de fundo cónico, como tubos de Eppendorf e armazená-los a-20 ° C. Observe que alíquotas SB podem ser descongeladas apenas uma vez.

2. recuperação e armazenamento de espécimes de coração adulto e Fetal

1. Armazenar o humanas adultas aurículas diretamente em cima da remoção durante a cirurgia em um tubo de 50 mL com 15 mL DMEM alta-glicose contendo 10% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. As amostras são geralmente 3-5 cm de tamanho e podem ser armazenadas até 48 h após a dissecação.
2. Armazenar o coração fetal obtida a partir de material de aborto eletivo em EPDC meio a 4 ° C até 24 h após o isolamento. Para este protocolo, use amostras com uma idade gestacional entre 12-22 semanas. Observe que o coração inteiro pode ser usado para a isolação do epicárdio.

3. isolamento da camada Epicárdica

1. No fluxo laminar, preparar um prato de cultura celular-100-mm com PBS e coloque uma gota separada (~ 200 µ l) de PBS na tampa. Encha um tubo de 15 mL com 5 mL de meio de EPDC previamente aquecido.
2. Coloque o tecido na cultura de pilha prato cheio de PBS. Certifique-se de que o tecido é umedecido com frequência durante o procedimento.
3. Usando um estereomicroscópio, retire o máximo da camada Epicárdica de amostra de tecido quanto possível por descascar usando fórceps.
   Nota: O epicárdio pode ser reconhecido como uma camada muito fina, transparente, firmemente aderida à parte externa do coração (figura 1A). Tente evitar contaminação com epicárdico tecido adiposo e vasos sanguíneos, pois isto vai dificultar o isolamento.
4. Recolha pedaços de tecido epicárdico em gota de PBS sobre a tampa.
5. Corte o tecido epicárdico em pedaços pequenos (0,5 mm³) usando um bisturi (figura 1B), ou usando as pontas afiadas de pequenas pinças. Note que as peças devem ser capazes de passar um P1, ponta da pipeta 000 (passo 3.6).
6. Adicione 1 mL de tripsina no tecido Epicárdica e recolher os pedaços e tripsina com um P1, 000 ponta da pipeta. Transferi o tecido em um tubo de centrifuga conico de 1,5 mL (Figura 1).
7. Incube o tubo em banho-maria 37 ° C por 10 min, agitando a ~ 60 rpm.
8. Retire o tubo do banho-maria e limpe o exterior do tubo com etanol a 70%.
9. Permitir que o tecido afundar até o fundo do tubo (Figura 1) e transferir cuidadosamente o sobrenadante contendo células Epicárdica para o tubo de 15 mL contendo 5 mL de meio de EPDC para inactivar a tripsina.
10. Repor o tecido restante no tubo de centrifuga conico com tripsina 1 mL e misture suavemente pipetando acima e para baixo.
11. Repita a etapa 3.7 a 3.10 duas vezes. Na etapa final, depois de um total de 30 min. de incubação de tripsina, transferi tanto o sobrenadante e o restante tecido epicárdico no tubo contendo meio EPDC.
12. Quando todas as células são coletadas em média EPDC, gentilmente passe a suspensão por meio de uma seringa de 10 mL com uma agulha de calibre 19 para um novo tubo de 15 mL para dissociar mecanicamente as células (Figura 1E).
    Nota: Certifique-se de homogeneizar a suspensão pipetando para cima e para baixo antes de passar a solução através da agulha para evitar que a agulha ficar obstruída.
13. Para ainda mais dissociar as células, repita a etapa 3.12 com uma agulha de calibre 21.
14. Coloque um filtro de célula de 100 µm em cima de um tubo de 50 mL e transferir a mídia que contém as células Epicárdica para o filtro usando uma pipeta de 10 mL para remover todos os restantes grupos (Figura 1F).
15. Lave o filtro para coletar células residuais pipetando 5 mL de meio de EPDC para o filtro.
16. A suspensão de células do tubo de 50 mL em um tubo de 15 mL de pipeta. Uma vez que as células afundam até o fundo do tubo, agite a solução antes de pipetagem.
    Nota: Enquanto este passo não é necessário, um tubo mais pequeno auxilia a visualização do sedimento após centrifugação.
17. Centrifugar a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (Figura 1).
18. Remover o sobrenadante e ressuspender as células (Figura 1 H) no volume necessário de médio EPDC (tabela 1).
    Nota: Para EPDCs fetais, use diretamente a médio EPDC contendo 10 µM do inibidor quinase ALK5 (EPDC + SB). Células adultas podem ser chapeadas sem SB durante a primeira passagem.
19. A suspensão de células em placas de cultura a gelatina revestida (Figura 1I) da placa. O tamanho do poço depende do tamanho da amostra de tecido Epicárdica (tabela 1). Observe que a confluência de baixa irá induzir a ocorrência de EMT.
20. Coloca as pilhas na incubadora pelo menos 48 h a 37 ° C, 5% de CO₂ para permitir que as células anexar a placa de cultura.

4. cultura de EPDCs

1. Reabastecer o meio EPDC + SB pelo menos a cada 3 dias.
2. Inspecione as células pelo menos a cada 3 dias usando o microscópio. Quando as células chegam a confluência, isto é, quando a placa de cultura é inteiramente coberta com células, passagem das células em uma proporção de 1:2 superfície. Note que, atingindo a confluência pode demorar ~ 5-10 dias.
   1. Aspire o meio usando uma pipeta ou um sistema de aspiração com, por exemplo, uma pipeta de vidro.
   2. Lave cuidadosamente as células adicionando PBS para as células. Suavemente a placa do redemoinho e aspire a PBS.
   3. Adicione tripsina à placa. Gire suavemente o prato para cobrir todas as células com tripsina e incubar a placa por 1 min a 37 ° C.
      Nota: Usar como tripsina pequena quanto possível (indicação: 200 µ l por alvéolo de um 6 placa bem)
   4. Bata a placa para separar mecanicamente as células da parte inferior da placa. Use o microscópio para verificar visualmente se as células têm destacado. Se não, incubar a placa de cultura de células para um minuto a mais.
   5. Adicionar o volume necessário de meio EPDC + SB para as células, resuspenda pipetando para cima e para baixo e a suspensão de células de transferência para uma nova placa de cultura de gelatina revestida.
      Nota: em geral, as células podem ser mantidas em uma morfologia de paralelepípedos até passagem 8.

5. indução de EMT em EPDCs

1. Para induzir a EMT, dissocia as células com tripsina e transferência das células para Nova gelatina revestido poços em uma proporção de 1:2 superfície médio EPDC + SB, conforme descrito em 4 e incubam durante pelo menos 24 h a 37 ° C, 5% de CO₂.
2. Cheque se Confluencia é 50-70% e se EPDCs têm uma morfologia de paralelepípedos.
   Nota: Confluência afeta a capacidade de EPDCs de se submeter a EMT.
3. Aspire o meio das células e lavar as células cuidadosamente com PBS (ver passo 4.2.1 - 4.2.2).
4. Estimulam as células com 1 ng/mL TGFβ3 médio EPDC e colocá-los em uma incubadora a 37 ° C, 5% de CO₂ por 5 dias. Observe que durante a estimulação, o meio EPDC contendo TGFβ3 não tem de ser reposta.
5. Monitore as células diariamente. Depois de 5 dias, as células que foram submetidos a EMT são reconhecidas por uma morfologia fusiforme (Figura 2A).
6. Cultura fusiformes EPDCs de acordo com o método descrito em 4 sem adição de SB ou TGFβ ao meio EPDC. Note que em geral, fusiformes EPDCs podem ser cultivadas até passagem 20.
7. Validar a ocorrência de EMT com coloração imunofluorescente usando anticorpos contra o αSMA mesenquimais marcadores ou vimentina ou pela faloidina para detectar a formação de fibras de estresse de F-Actina (Figura 2B), ou usando qRT-PCR para os genes relacionados com EMT ( por exemplo,, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, caracol, lesma) (Figura 2 e tabela 2).

Resultados

Aqui, nós esboçamos um protocolo simples para isolar EPDCs de humano adulto e fetal tecido cardíaco (Figura 1). Este protocolo tira proveito da localização facilmente acessível do epicárdio do lado de fora do coração (figura 1A). Coloração da orelha coração após dissecação demonstra que o epicárdio WT1 + é removido enquanto o subjacente subepicardial da matriz extracelular e o tecido do miocárdio permanecem int...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultura primárias Epicárdica células derivadas de corações humanos adultas e fetais. Extensa caracterização dessas células tem sido publicado anteriormente¹⁷. Mostramos que os dois tipos de células podem ser mantidos como células epiteliais de paralelepípedos, como quando cultivadas com o inibidor de quinase ALK5 SB431542. EMT é parte integrante da ativação epicárdico na vivo durante o desenvolvimento e a resposta pós-l...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083