Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

Özet

Epicardium hücreleri ve büyüme faktörleri miyokardiyal duvara sağlayarak geliştirme ve onarım kalp önemli bir rol oynar. Burada, çalışma ve gelişimsel ve yetişkin özellikleri karşılaştırma sağlar kültür insan birincil epicardial hücreleri yöntemine açıklayın.

Özet

Epicardium, Miyokardiyum kapsayan bir epitel hücre katmanı iskemik yaralanma sonra kalp geliştirme sırasında hem de onarım yanıt kalp önemli bir rol vardır. Aktif hale getirildiğinde, epicardial hücreleri epitelyal Mezenkimal geçiş (EMT) hücreleri Yenileyici Miyokardiyum için sağlamak için bilinen bir sürecinden geçmeleri. Ayrıca, epicardium temel parakrin faktörler salgılanmasını katkıda bulunur. Tam takdir epicardium rejeneratif potansiyelini ortaya çıkarmak için bir insan hücre modeli gereklidir. Burada bir roman hücre kültür model birincil epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) insan yetişkin ve fetal kalp dokudan türetmek için anahat. EPDCs izole etmek için epicardium kalp numune dışarıdan disseke ve bir tek hücre süspansiyon işlenmiş. Ardından, EPDCs kaplama ve ALK 5-kinaz inhibitörü onların epitel fenotip korumak için SB431542 içeren EPDC ortamda kültürlenir. EMT stimülasyon ile TGFβ tarafından indüklenen. Bu yöntem sağlar, ilk kez, kontrollü bir ortamda insan epicardial EMT sürecinin incelenmesi ve kalp rejenerasyon yardımcı olabilir EPDCs secretome daha fazla anlayış kazanıyor kolaylaştırır. Ayrıca, bu üniforma yaklaşım insan yetişkin ve fetal epicardial davranışını doğrudan karşılaştırma için sağlar.

Giriş

Epicardium, zarflar, olduğunu kalp geliştirme ve (gözden Smits ve ark. tamir için hayati önemi olan bir tek hücreli epitel tabaka ¹). proepicardial organ, gelişmekte olan kalp tabanında bulunan küçük bir yapı developmentally, epicardium kaynaklanmaktadır. Gelişimsel güne E9.5 fare ve 4 hafta sonrası anlayışı insan, hücreleri bu karnabahar yapısından geçirmek ve kapak gelişmekte olan Miyokardiyum²başlayın. Bir kez bir tek epitel hücre katmanı oluşturulur, bir kısmını epicardial hücreleri epitel Mezenkimal geçiş (EMT) uğrar. EMT sırasında hücreleri epitel onların niteliklerinden hücre-hücre yapışıklıklar, kaybetmek ve onları gelişen Miyokardiyum geçirmek için kapasitesi sayesinde daha çok bir Mezenkimal fenotip elde edilir. Her ne kadar ikinci farklılaşma iki hücre fibroblastlar, düz kas hücreleri ve potansiyel olarak cardiomyocytes ve endotel hücreleri³, gibi çeşitli kardiyak hücre türleri kurulan epicardial türetilmiş hücre (EPDCs) ayırt nüfus kalır (gözden Smits ve ark. içinde tartışma konu ⁴). Ayrıca, onun büyüme ve vaskülarizasyon^5,6,7,8düzenlemek için öğretici parakrin sinyalleri Miyokardiyum için epicardium sağlar. Engelli epicardial oluşumu kalp kası^9,10, damarlara¹¹ve iletim sistemi¹²temel vurgu, gelişimsel hatalarına yol açar birden fazla çalışmalar göstermiştir epicardium kalp oluşumu için katkı.

Yetişkin kalbinde epicardium uyuyan bir katman olarak mevcut olsa da, iskemi¹³yeniden olur. Epicardial yeniden etkinleştirme sonrası yaralanma beyannamedir birkaç işlemler yayılması ve EMT¹⁴, olsa da dahil olmak üzere kalp geliştirme için daha az verimli bir şekilde açıklanan. İlginçtir, her ne kadar kesin mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir, onarmak için epicardial katkı tedavi ile örneğin, Thymosin β4¹⁵ tarafından geliştirilmiş veya VEGF-bir mRNA¹⁶iyileştirmiştir kalp kaynaklanan, değişikliğin Miyokard İnfarktüsü sonra işlev. Epicardium bu nedenle endojen onarım yaralı kalp geliştirmek için ilginç bir hücre kaynak olarak kabul edilir.

Kalp Geliştirme mekanizmalarının kez yaralanma sırasında daha az verimli bir şekilde her ne kadar recapitulated. Epicardial aktivatörleri arayışı içinde belirlemek ve fetal ve yetişkin epicardium tam kapasite karşılaştırmak önemlidir. Ayrıca, terapötik bir bakış açısından bu hayvan deneyleri ek olarak, biz bilgi ile ilgili insan epicardium yanıt uzatmak önemlidir. Burada, izole ve insan yetişkin ve fetal epicardial türetilmiş hücrelerinde (EPDCs) bir epitel hücre gibi Morfoloji kültür ve EMT ikna etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model ile keşfetmek ve yetişkin ve fetal epicardial hücre davranış karşılaştırın hedefliyoruz.

Bu iletişim kuralı en büyük avantajı değil iyice incelenmiştir insan epicardial malzeme kullanmaktır. Önemlisi, açıklanan yalıtım ve hücre kültürü iletişim kuralı bu iki hücre kaynakları arasında doğrudan bir karşılaştırma etkinleştirme her iki fetal ve yetişkin Arnavut kaldırımı EPDCs türetmek için tek bir üniforma yöntemi sağlar. Ayrıca, epicardium, konuma göre izole olduğu için aslında epicardially türetilmiş¹⁷hücrelerdir sağlanmaktadır.

İnsan EPDC izolasyon yöntemleri daha önce kurulmuş olan sağlarken, bunlar çoğunlukla nerede kalp veya epicardial doku parçaları bir hücre kültür çanak^18,19kaplama yapılan protokol bağlıdır. Bu yaklaşım böylece bunu kısmen geçirmek için onların epitel fenotip kaybetmek ve spontan EMT geçmesi daha eğilimli olan özellikle hücreleri için seçer. Geçerli protokol epicardium epitel onların durumunu korumak izole EPDCs sağlayan bir tek hücre çözümü önce işlenir. Bu yöntem bu nedenle epicardial EMT eğitim için bir katı vitro modeli sağlar.

Protokol

İnsan dokusu numuneler ile tüm deneyler Leiden Üniversitesi Tıp Merkezi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Helsinki Deklarasyonu için uygundur. Tüm adımlar bir hücre kültür akışı kabine steril ekipmanları ile gerçekleştirilir.

1. hazırlıkları

1. EPDC orta Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM düşük-glikoz) ve orta 199 (M199) 1:1 oran içinde karıştırarak hazırlayın. % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS, 25 dk 56 ° c için inaktive ısı) ekleyin ve ilave 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile. 37 ° C su banyosu EPDC ortamda önceden ısıtmak.
2. Tripsin önceden sıcak 0.25%/EDTA (1:37 ° C su banyosunda 1).
3. Wells jelatin ile kat. Her şey için % 0,1 jelatin/PBS ekleyin ve en az 15 dakika 37 ° C'de plakaları kuluçkaya Yönergeleri gerekli hücre kültür plaka için Tablo 1' de özetlenmiştir. Dikkatli bir şekilde tüm sıvı hücreleri kaplama önce çıkarın.
4. DMSO (dikkat) seyreltilmiş hisse senedi çözeltisi 10 mM SB431542 (SB), hazır olun. Eppendorf tüpleri gibi konik alt polipropilen santrifüj tüpleri 50 µL aliquots yapmak ve onları-20 ° C'de depolayın SB aliquots yalnızca bir kez çözdürülen unutmayın.

2. alma ve depolama yetişkin ve Fetal kalp örneklerin

1. 15 mL ile 50 mL tüp içinde saklamak kaldırma ameliyatı sırasında üzerine doğrudan insan yetişkin auricles %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin 4 ° C'de içeren yüksek glikoz DMEM Örnekler genellikle 3-5 cm boyutunda ve ilâ saklanabilir diseksiyon sonra 48 saat.
2. Fetal kalp yalıtım sonra seçmeli kürtaj malzeme 24 s kadar 4 ° C'de EPDC ortamda elde edilen saklayın. Bu iletişim kuralı için 12-22 hafta arasında gebelik yaşı ile örnekleri kullanır. Not tüm kalp epicardium yalıtım için kullanılabilir.

3. yalıtım Epicardial tabakasının

1. Laminar akışı kabine PBS ile 100 mm hücre kültürü yemek hazırlamak ve PBS, ayrı bir damlacık (~ 200 µL) kapağı yerleştirin. 15 mL tüp 5 mL Önceden ısıtılmış EPDC orta ile doldurun.
2. Doku PBS ile dolu hücre kültürü çanak yerleştirin. Doku işlem sırasında sık sık nemlendirilmiş emin olun.
3. Bir stereomicroscope kullanarak, daha fazla doku örneği mümkün olduğunca epicardial katmandan kaldırmak forseps kullanarak kapalı soyulması tarafından.
   Not: epicardium bir çok ince, şeffaf tabaka sıkıca kalp (şekil 1A) dışa doğru uydurdugunuz hikayeye bagli olarak kabul edilebilir. Bu yalıtım engel olacaktır beri epicardial yağ dokusu ve kan damarları ile kirlenmesini önlemek deneyin.
4. PBS damlacığı epicardial doku parçaları kapağını toplamak.
5. Bir neşter (şekil 1B) ya da küçük forseps keskin uçları kullanarak epicardial doku (0,5 mm³) küçük parçalara kesilmiş. Parçaları bir P1 geçmek gerekir Not 000 damlalıklı ipucu (Adım 3.6).
6. Tripsin 1 mL epicardial doku ekleyin ve parçalar ve tripsin bir P1, 000 damlalıklı ipucu ile toplamak. Doku 1.5 mL konik santrifüj tüpüne (şekil 1 c) aktarın.
7. 10 dk, bir 37 ° C su banyosunda tüp ~ 60 rpm'de sallayarak süre kuluçkaya.
8. Tüp su banyosundan çıkarın ve % 70 etanol ile tüp dýþýna temizleyin.
9. Doku tüp (şekil 1 d) altına lavabo ve dikkatle tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için 5 mL EPDC orta içeren 15 mL tüp epicardial hücreleri içeren süpernatant aktarmak izin.
10. Konik santrifüj tüpü 1 mL tripsin ile kalan dokuda doldurmak ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
11. 3.7-3.10 iki kez tekrarlayın. Son adımda, tripsin kuluçka, 30 dk toplam sonra süpernatant ve kalan epicardial doku EPDC orta içeren tüp içine aktarın.
12. Tüm hücreleri EPDC ortamda toplandığında, yavaşça süspansiyon 10 mL şırınga ile 19 G'lik iğneyi mekanik olarak hücreleri (şekil 1E) ayırmak için yeni bir 15 mL tüp geçmek.
    Not: yukarı ve aşağı tıkalı iğne önlemek için iğne çözüm geçirmeden önce pipetting tarafından süspansiyon homojenize emin olun.
13. Daha fazla hücreleri ayırmak için 3,12 21'lik iğne ile adımları yineleyin.
14. Üzerine 50 mL tüp 100 µm hücre süzgeç koyun ve tüm kalan kümeleri (şekil 1F) kaldırmak için bir 10 mL pipet kullanarak süzgeç üzerine epicardial hücreleri içeren orta aktarın.
15. 5 mL EPDC orta süzgeç üzerine pipetting tarafından kalan hücreleri toplamak için süzgeç yıkayın.
16. Damlalıklı hücre süspansiyon 50 mL tüp 15 mL tüp içine. Hücreleri tüp altına lavabo beri çözüm pipetting önce yavaşça salla.
    Not: Bu adım gerekli değildir, ancak daha küçük bir tüp Pelet görselleştirme Santrifüjü sonra yardımcı olur.
17. 200 x g (şekil 1G) oda sıcaklığında 5 min için de santrifüj kapasitesi.
18. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet (şekil 1 H) EPDC orta (Tablo 1) gerekli hacmi resuspend.
    Not: fetal EPDCs için doğrudan EPDC orta ALK5 kinaz inhibitörü (EPDC + SB) 10 µM içeren kullanın. Yetişkin hücreler SB ilk geçiş sırasında kaplama.
19. Jelatin kaplı kültür plakaları (şekil 1I) hücre süspansiyon plaka. Kuyu boyutunu epicardial doku örneği (Tablo 1) boyutuna bağlıdır. Düşük confluency EMT oluşumunu teşvik unutmayın.
20. En az 48 saat 37 ° c, % 5 CO₂ hücre kültür plakasına eklemek izin vermek için kuluçka hücreleri yerleştirin.

4. Kültür EPDCs

1. EPDC + SB orta en az 3 günde doldurmak.
2. Hücreleri en az her 3 gün mikroskop kullanarak kontrol edin. Ne zaman ne zaman kültür plaka tamamen hücrelerle örtülüdür hücreleri confluency, Yani, ulaşmak, bir 1:2 yüzey oranı hücrelerde geçiş. Confluency ulaşan ~ 5-10 gün sürebilir unutmayın.
   1. Örneğin, bir cam damlalıklı bir damlalıklı veya bir aspirasyon sistemi kullanarak orta Aspire edin.
   2. Hücreleri dikkatle PBS hücrelere ekleyerek yıkayın. Yavaşça plaka girdap ve PBS Aspire edin.
   3. Tripsin plaka ekleyin. Tripsin içeren hücrelerin tümünü kapsar ve 1 dk. 37 ° C'de plaka kuluçkaya için plaka Yavaşça döndürün
      Not: Kullanmak mümkün olduğunca küçük tripsin olarak (gösterge: 6 kuyu başına 200 µL de plaka)
   4. Mekanik olarak alt plaka hücrelerden ayırmak için plaka dokunun. Mikroskop görsel olarak hücreleri ayırdıktan denetlemek için kullanın. Eğer değilse, hücre kültür plaka ilave bir dakikalığına kuluçkaya.
   5. EPDC + SB orta gerekli hacmi hücrelere ekleme, yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend ve hücre süspansiyon yeni bir jelatin kaplı kültür tabağa aktarın.
      Not: genel olarak, hücre içinde bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji geçiş 8 kadar tutulabilir.

5. indüksiyon EMT EPDCs içinde

1. EMT ikna etmek için hücreleri tripsin ve yeni jelatin hücrelere kuyu 1:2 yüzey oranında EPDC + SB ortamda 4'te açıklandığı gibi kaplı ve en az 24 h 37 ° c, % 5 CO₂için kuluçkaya transfer ayırmak.
2. Onay confluency % 50-70 ve EPDCs bir Arnavut kaldırımlı Morfoloji varsa ise.
   Not: Confluency EMT geçmesi EPDCs yeteneğini etkiler.
3. Hücreleri ortamından Aspire edin ve PBS dikkatle hücrelerle yıkayın (bkz. Adım 4.2.1 - 4.2.2).
4. 1 ng/mL TGFβ3 EPDC ortamda içeren hücreleri uyarmak ve 37 ° c, % 5 CO₂ 5 gün için bir kuluçka yer onları. Stimülasyon sırasında doldurulan TGFβ3 içeren EPDC orta sahip olmadığını unutmayın.
5. Hücreleri her gün izlemek. 5 gün sonra EMT uygulandı hücreleri bir seklinde Morfoloji tarafından (şekil 2A) kabul edilmektedir.
6. Kültür EPDCs SB veya TGFβ eklenmesi EPDC orta olmadan 4 açıklanan yöntemine göre seklinde. Genel olarak, EPDCs seklinde Not geçiş 20 kadar kültürlü.
7. İmmünfloresan boyama ile EMT oluşumunu doğrulamak antikorlar Mezenkimal işaretleri αSMA veya Vimentin karşı veya phalloidin tarafından F-aktin stres lifleri (şekil 2B) oluşumu tespit etmek ya da qRT-PCR EMT ilgili genler ( kullanarak Örneğin, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, salyangoz, Slug) (şekil 2C ve Tablo 2).

Sonuçlar

Burada, EPDCs insan yetişkin ve fetal kalp dokusu (şekil 1) izole etmek için basit bir protokol anahat. Bu iletişim kuralı, kalp (şekil 1A) dışarıdan epicardium kolay erişilebilecek bir konuma yararlanır. Diseksiyon temel subepicardial hücre dışı matriks ve miyokard dokusu bozulmamış (şekil 1J) kalırken WT1 + epicardium kaldırılır gösterir sonra kalp auricle boyama. Geniş kara...

Tartışmalar

Burada bir yalıtmak için detaylı Protokolü ve birincil epicardial hücreleri insan yetişkin ve fetal kalp türetilmiş kültür açıklar. Kapsamlı bu hücrelerin karakterizasyonu önceden yayınlanan¹⁷oldu. Biz her iki hücre tipleri ALK5 kinaz inhibitörü SB431542 ile kültürlü zaman epitel Arnavut kaldırımlı benzeri hücreler olarak muhafaza edilmesi göstermiştir. EMT geliştirme ve sonrası yaralanma yanıt sırasında epicardial harekete geçirmek içinde vivo ayrılmaz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083