Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

Zusammenfassung

Die Epicardium spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Reparatur des Herzens durch die Bereitstellung von Zellen und Wachstumsfaktoren der myokardialen Wand. Hier beschreiben wir eine Methode, um menschliche primäre epicardial Zellkulturen, die die Studie und den Vergleich ihrer Entwicklungs- und Erwachsenen Eigenschaften ermöglicht.

Zusammenfassung

Epicardium, eine epitheliale Zellschicht auf das Myokard hat eine wesentliche Rolle während der kardialen Entwicklung, sowie die Reparatur als Reaktion des Herzens nach ischämischen Verletzung. Wenn aktiviert, durchlaufen epicardial Zellen ein Verfahren bekannt als epitheliale Mesenchymale Transition (EMT) Zellen zu regenerierenden Myokard zu bieten. Darüber hinaus trägt die Epicardium durch Sekretion von wesentlichen Parakrine Faktoren. Um das regenerative Potential der Epicardium vollständig zu verstehen, ist eine menschliche zellenmodell erforderlich. Hier beschreiben wir eine neuartige Zellmodell der Kultur um menschliche Erwachsene und fetalen Herzgewebe primäre epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) abgeleitet. Um EPDCs zu isolieren, ist die Epicardium von außen auf das Herz-Exemplar seziert und zu einem einzigen Zellsuspension verarbeitet. Als nächstes sind EPDCs überzogen und in EPDC die ALK-5-Kinase-Inhibitor SB431542 weiterhin ihre epithelialen Phänotyps-haltigem Medium kultiviert. EMT wird durch Stimulation mit TGFβ induziert. Diese Methode ermöglicht zum ersten Mal die Untersuchung des Prozesses der menschlichen epicardial EMT in einer kontrollierten Umgebung und ermöglicht mehr Einblick in die Secretome des EPDCs, das Herz Regeneration helfen kann. Darüber hinaus ermöglicht dieser einheitlichen Ansatz zum direkten Vergleich der menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial Verhalten.

Einleitung

Die Epicardium, eine einzellige Epithelschicht, dass Umschläge das Herz ist von entscheidender Bedeutung für die kardiale Entwicklung und Reparatur (rezensiert in Smits Et al. ¹). Entwicklungsgeschichtlich, die Epicardium ergibt sich aus der Proepicardial-Orgel, eine kleine Struktur, die am Fuße des Herzens entwickeln. Um Entwicklungsstörungen Tag E9.5 Maus und 4 Wochen Post-Konzeption in der Human-beginnen Zellen migrieren aus dieser Blumenkohl-Struktur und decken die entwickelnden Myokard-². Sobald ein einzelnes epitheliale Zellschicht gebildet wird, wird ein Teil der epicardial Zellen epithelialen, Mesenchymale Transition (EMT) unterzogen. Während EMT Zellen verlieren ihre epithelialen Eigenschaften wie Zell-Zell-Verwachsungen, und erhalten einen mesenchymalen Phänotyp verleiht ihnen die Fähigkeit, in den Entwicklungsländern Myokard einwandern. Die gebildeten epicardial abgeleiteten Zellen (EPDCs) können in mehrere kardiale Zelltypen, einschließlich der Fibroblasten, glatten Muskelzellen und potenziell Kardiomyozyten und Endothelzellen³, unterscheiden, obwohl Zell-Differenzierung des letzteren zwei Populationen bleibt Gegenstand der Debatte (rezensiert in Smits Et al. ( ⁴). Darüber hinaus bietet die Epicardium lehrreich Parakrine Signale an den Herzmuskel, deren Wachstum und Vaskularisierung^5,6,7,8zu regulieren. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Sehbehinderte epicardial Bildung zu Entwicklungsschäden im Herzmuskel^9,10, Gefäßsystem¹¹und Wärmeleitung System^{12 führt}, betont das wesentliche Beitrag von Epicardium zur Bildung des Herzens.

Obwohl Erwachsene inmitten der Epicardium als ruhende Schicht vorhanden ist, wird es bei der Ischämie¹³reaktiviert. Epicardial Reaktivierung nach der Verletzung mehrere rekapituliert die Prozesse beschrieben für kardiale Entwicklung, einschließlich Verbreitung und EMT¹⁴, wenn auch weniger effizient. Interessant ist, obwohl der genaue Mechanismus ist nicht vollständig geklärt, die epicardial Beitrag zur Reparatur kann durch Behandlung mit z. B.Thymosin β4¹⁵ verbessert werden oder geändert VEGF-A mRNA¹⁶, wodurch verbesserte Herz-Kreislauf Funktion nach Myokardinfarkt. Die Epicardium gilt daher eine interessante Zelle Quelle, endogene Reparatur des Geschädigten Herzens zu verbessern.

Mechanismen der kardialen Entwicklung sind oft bei Verletzungen, obwohl auf eine weniger effiziente Weise zusammengefaßt. Auf der Suche nach epicardial Aktivatoren ist es sehr wichtig, dass wir bestimmen und die volle Kapazität des fetalen und adulten Epicardium vergleichen. Aus therapeutischer Sicht ist es darüber hinaus wichtig, dass neben der Tierversuche, wir wissen in Bezug auf die Reaktion des menschlichen Epicardium erweitern. Hier beschreiben wir eine Methode zur Isolierung und Kultur menschlichen Erwachsenen und fetalen epicardial abgeleitete Zellen (EPDCs) in einer epithelialen Zellen ähnliche Morphologie und EMT zu induzieren. Mit diesem Modell wollen wir entdecken und vergleichen Sie Erwachsene und fetalen epicardial Zelle Verhalten.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von epicardial Menschenmaterial, die nicht gründlich untersucht worden. Wichtig ist, sieht das beschriebene Isolation und Zelle Kultur-Protokoll eine einzige einheitliche Methode um beide fetalen und adulten Kopfsteinpflaster EPDCs, so dass einen direkten Vergleich zwischen diesen beiden Quellen abzuleiten. Zusätzlich, da die Epicardium isoliert aufgrund seiner Lage ist, ist sichergestellt, dass die Zellen tatsächlich epicardially abgeleiteten¹⁷.

Während menschliche EPDC Isolierung Methoden bereits aufgebaut haben, setzen diese meist auf Auswuchs Protokolle wo Stücke von Herz- oder epicardial Gewebe auf eine Zelle Kultur Teller^18,19überzogen sind. Dieser Ansatz wählt dabei speziell für Zellen, die teilweise ihre epithelialen Phänotyps verlieren, um zu migrieren, und sind anfälliger für spontane EMT unterziehen. In das aktuelle Protokoll erfolgt die Epicardium zuerst in eine einzelne Zelle Lösung erlaubt die isolierte EPDCs um ihre epitheliale Status beizubehalten. Diese Methode stellt daher eine solide in-Vitro -Modell, um epicardial EMT zu studieren.

Protokoll

Alle Experimente mit menschlichen Gewebeproben wurden von der Ethikkommission des Leiden University Medical Center genehmigt und entspricht der Deklaration von Helsinki. Alle Schritte werden mit steriler Ausrüstung in einer Zelle Kultur Strömung Schrank ausgeführt.

1. Vorbereitungen

1. Bereiten Sie EPDC Medium durch Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM Low-Glucose) und Medium 199 (M199) im Verhältnis 1:1 mischen. Fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fötalen Rinderserum (FBS, Hitze inaktiviert für 25 min bei 56 ° C) und mit 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin ergänzt. Vorwärmen der EPDC Medium in einem 37 ° C-Wasserbad.
2. Vorwärmen Trypsin 0.25%/EDTA (1:1) in einem 37 ° C-Wasserbad.
3. Mantel-Brunnen mit Gelatine. Hinzufügen von 0,1 % Gelatine/PBS in jede Vertiefung und die Platten für mindestens 15 Minuten bei 37 ° c inkubieren Richtlinien für die erforderliche Zellplatte Kultur sind in Tabelle 1zusammengefasst. Entfernen Sie vorsichtig alle Flüssigkeit vor der galvanischen Zellen.
4. Bereiten Sie eine Stammlösung von 10 mM SB431542 (SB), verdünnt in DMSO (Vorsicht). 50 µL-Aliquots in konischen Boden aus Polypropylen Zentrifuge Röhren, wie Eppendorf Röhren, und speichern Sie diese bei-20 ° C. Beachten Sie, dass SB Aliquote nur einmal aufgetaut werden können.

2. Abruf und Speicherung von Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

1. Speichern von menschlichen Erwachsenen Ohrmuscheln direkt nach Entnahme während der Operation in einen 50-mL-Tube mit 15 mL High-Glukose DMEM mit 10 % FBS, 100 U/mL Penicillin und 100 mg/mL Streptomycin bei 4 ° C. Proben sind in der Regel ca. 3-5 cm groß und kann gespeichert werden, bis zu 48 h nach Dissektion.
2. Speichern Sie fetalen Herzen aus elektiven Abtreibung Material in EPDC Medium bei 4 ° C bis zu 24 h nach Isolierung erhalten. Verwenden Sie für dieses Protokoll Proben mit einem Gestationsalter zwischen 12-22 Wochen. Beachten Sie, dass das ganze Herz zur Isolation von der Epicardium verwendet werden kann.

3. Isolation der Epicardial Schicht

1. Bereiten Sie in der Laminar-Flow Kabinett ein 100-mm-Zellkultur-Gericht mit PBS und ein separates Tröpfchen (~ 200 µL) PBS im Deckel. Füllen Sie eine 15-mL-Tube mit 5 mL vorgewärmten EPDC Medium.
2. Legen Sie das Gewebe in der Zellkultur Schale gefüllt mit PBS. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe während des Verfahrens häufig befeuchtet wird.
3. Mit einem Stereomikroskop, so viel der epicardial Schicht aus der Gewebeprobe möglichst durch Abziehen mit Pinzette entfernen.
   Hinweis: Die Epicardium kann erkannt werden, da eine sehr dünne, transparente Schicht dicht an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A) eingehalten. Versuchen Sie, die Kontamination mit epicardial Fettgewebe und Blutgefäßen zu vermeiden, da dies die Isolierung behindern wird.
4. Sammeln Sie Stücke von epicardial Gewebe in den Tropfen des PBS auf dem Deckel.
5. Schneiden Sie das epicardial Gewebe in kleine Stücke (0,5 mm³) mit einem Skalpell (Abbildung 1 b) oder mit den scharfen Spitzen der kleinen Zange. Beachten Sie, dass die Stücke ein P1 weitergeben zu können sollten 000 pipettieren Tipp (Schritt 3,6).
6. Das epicardial Gewebe 1 mL Trypsin hinzu und sammeln Sie die Stücke und Trypsin mit P1, 000 pipettieren Tipp. Übertragen Sie das Gewebe in eine 1,5 mL konische Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1).
7. Inkubieren Sie das Rohr im Wasserbad 37 ° C für 10 min, unter Schütteln bei ~ 60 u/min.
8. Nehmen Sie das Rohr aus dem Wasserbad und reinigen Sie die Außenseite des Rohres mit 70 % Ethanol.
9. Lassen Sie das Gewebe auf den Boden des Rohres (Abbildung 1) sinken und sorgfältig übertragen des Überstands epicardial Zellen um die 15-mL-Tube mit 5 mL EPDC Medium um die Trypsin zu inaktivieren.
10. Füllen Sie das restliche Gewebe in die konische Zentrifugenröhrchen mit 1 mL Trypsin auf, und mischen Sie, indem Sie sanft auf und ab pipettieren.
11. Wiederholen Sie Schritt 3,7 bis 3.10 zweimal. Im letzten Schritt nach insgesamt 30 min Inkubation Trypsin, übertragen der überstand und das restliche epicardial Gewebe in das Rohr mit EPDC Medium.
12. Wenn alle Zellen in EPDC Medium gesammelt sind, durchlaufen Sie sanft die Aussetzung einer 10 mL Spritze mit einer 19-Gauge-Nadel in eine neue 15-mL-Tube die Zellen (Abbildung 1E) mechanisch zu trennen.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Aussetzung zu homogenisieren, durch pipettieren rauf und runter, bevor man die Lösung durch die Nadel, die Nadel immer behindert zu verhindern.
13. Um die Zellen weiter zu distanzieren, wiederholen Sie Schritt 3.12 mit einer 21-Gauge-Nadel.
14. Legen Sie ein 100 µm Zelle Sieb auf einen 50-mL-Tube und übertragen Sie die epicardial Zellen auf das Sieb mit einer 10 mL-Pipette um alle restlichen Klumpen (Abb. 1F) zu entfernen-haltigem Medium zu.
15. Waschen Sie das Sieb verbleibende Zellen sammeln durch pipettieren 5 mL EPDC Medium auf das Sieb.
16. Pipettieren der Zellsuspension aus dem 50-mL-Röhrchen in eine 15-mL-Tube. Da Zellen an der Unterseite des Rohres zu versenken, schütteln Sie die Lösung leicht vor dem pipettieren.
    Hinweis: Dieser Schritt ist, zwar nicht notwendig hilft ein kleiner Schlauch Visualisierung des Geschosses nach Zentrifugation.
17. Zentrifugieren Sie bei 200 X g für 5 min bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
18. Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet (Abbildung 1 H) in die gewünschte Lautstärke des EPDC Medium (Tabelle 1).
    Hinweis: Für fetale EPDCs verwenden Sie direkt EPDC Medium mit 10 µM von der ALK5-Kinase-Inhibitor (EPDC + SB). Adulten Zellen können während der ersten Passage ohne SB überzogen.
19. Platte der Zellsuspension auf die Gelatine beschichtet-Kultur-Platten (Abbildung 1I). Die Größe des Brunnens hängt von der Größe der epicardial Gewebeprobe (Tabelle 1). Beachten Sie, dass niedrige Konfluenz das Auftreten von EMT induziert wird.
20. Legen Sie die Zellen in den Inkubator für mindestens 48 h bei 37 ° C, 5 % CO₂ damit die Zellen an der Kultur-Platte befestigen.

(4) Kultur der EPDCs

1. Ergänzen Sie das EPDC + SB-Medium mindestens alle 3 Tage.
2. Überprüfen Sie die Zellen mindestens alle 3 Tage das Mikroskop. Wenn die Zellen Konfluenz, d. h., erreichen wenn die Kultur-Platte voll mit Zellen bedeckt ist, die passage der Zellen im Verhältnis 1:2 Oberfläche. Beachten Sie, dass erreichen Konfluenz ~ 5-10 Tage dauern kann.
   1. Aspirieren Sie das Medium mit einem pipettieren oder eine Aspirationssystem mit z. B.einem Glas pipettieren.
   2. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von PBS zu den Zellen vorsichtig. Vorsichtig schwenken der Plattenrandes und Aspirieren der PBS.
   3. Hinzu kommt die Platte Trypsin. Drehen Sie vorsichtig die Platte, um alle Zellen mit Trypsin zu decken und die Platte für 1 min bei 37 ° c inkubieren
      Hinweis: Verwenden Sie als kleine Trypsin wie möglich (Hinweis: gut 200 µL pro Bohrloch einer 6 Teller)
   4. Tippen Sie auf die Platte, um die Zellen von der Unterseite der Platte mechanisch zu lösen. Verwenden Sie das Mikroskop, um visuell zu überprüfen, ob Zellen getrennt haben. Wenn dies nicht der Fall ist, eine zusätzliche Minute Kultur Zellplatte inkubieren.
   5. Fügen Sie das erforderliche Volumen der EPDC + SB-Medium auf die Zellen, Aufschwemmen durch pipettieren rauf und runter und die Zellsuspension auf eine neue Gelatine beschichtet-Kultur-Platte zu übertragen.
      Hinweis: im Allgemeinen können Zellen in einer gepflasterten Morphologie bis Durchgang 8 gehalten werden.

5. Induktion von EMT in EPDCs

1. EMT induzieren, distanzieren Sie sich die Zellen mit Trypsin und Transfer der Zellen zu neuen Gelatine beschichtete Brunnen im Verhältnis 1:2 Oberfläche in EPDC + SB Medium, wie unter 4 beschrieben, und inkubieren Sie für mindestens 24 Stunden bei 37 ° C, 5 % CO₂.
2. Check ist wenn confluency 50-70 % und haben EPDCs eine Kopfsteinpflaster-Morphologie.
   Hinweis: Konfluenz beeinträchtigt die Fähigkeit der EPDCs EMT zu unterziehen.
3. Aspirieren Sie das Medium aus den Zellen und die Zellen vorsichtig mit PBS waschen (siehe Punkt 4.2.1 - 4.2.2).
4. Stimulieren Sie Zellen mit 1 ng/mL TGFβ3 in EPDC Medium zu, und legen Sie sie in einem Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO₂ für 5 Tage. Beachten Sie, dass während der Stimulation, TGFβ3-haltigem EPDC-Medium nicht wieder aufgefüllt werden muss.
5. Die Zellen sind täglich zu überwachen. Nach 5 Tagen sind Zellen, die EMT erfuhr eine spindelförmige Morphologie (Abbildung 2A) anerkannt.
6. Kultur spindelförmige EPDCs nach der Methode in 4 ohne Zusatz von SB oder TGFβ EPDC Medium beschrieben. Beachten Sie, dass in der Regel spindelförmig EPDCs bis Durchgang 20 kultiviert werden können.
7. Überprüfen Sie das Auftreten von EMT mit immunofluorescent Färbung mit Antikörpern gegen die mesenchymalen Marker αSMA oder Vimentin oder durch Phalloidin, um die Bildung von F-Aktin Stress Fasern (Abb. 2 b) zu erkennen, oder mittels qRT-PCR für EMT-Genen ( z.B., WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, Schnecke, Schnecke) (Abbildung 2 und Tabelle 2).

Ergebnisse

Hier beschreiben wir eine einfache Protokoll zur EPDCs von menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzgewebe (Abbildung 1) zu isolieren. Dieses Protokoll nutzt die verkehrsgünstige Lage der Epicardium an der Außenseite des Herzens (Abbildung 1A). Färbung des Herzens Ohrmuschel nach Dissektion zeigt, dass die WT1 + Epicardium entfernt wird, während die zugrunde liegenden Subepicardial extrazelluläre Matrix und Herzmuskelgewebe ...

Diskussion

Hier beschreiben wir ein ausführliches Protokoll zu isolieren und Kultur primäre epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzen abgeleitet. Umfassende Charakterisierung dieser Zellen wurde bisher veröffentlichten¹⁷. Wir haben gezeigt, dass beide Zelltypen als Epithelzellen Kopfsteinpflaster-wie, wenn mit dem ALK5-Kinase-Inhibitor SB431542 kultiviert aufrechterhalten werden können. EMT ist fester Bestandteil des epicardial Aktivierung in Vivo während der Entwicklung...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083