L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain

Résumé

L’épicarde joue un rôle crucial dans le développement et la réparation du coeur en fournissant des cellules et facteurs de croissance à la paroi myocardique. Nous décrivons ici une méthode aux cellules humaines d’épicardique principale culture qui permet l’étude et la comparaison de leurs caractéristiques développementales et adultes.

Résumé

L’épicarde, une couche de cellules épithéliales couvrant le myocarde, a un rôle essentiel au cours du développement cardiaque, ainsi que dans la réponse de réparation du coeur après une lésion ischémique. Lorsqu’il est activé, les cellules épicardiques subissent un processus appelé épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT) pour assurer les cellules vers le myocarde en régénération. En outre, l’épicarde contribue par l’intermédiaire de la sécrétion de facteurs paracrines essentiel. Pour apprécier pleinement le potentiel de régénération de l’épicarde, un modèle de cellule humaine est nécessaire. Ici, nous présentons un modèle de culture cellulaire roman pour dériver des cellules dérivées épicardiques primaires (EPDCs) de tissu cardiaque adult et du foetus humain. Pour isoler le EPDCs, l’épicarde est disséqué de l’extérieur de l’échantillon de cœur et transformée en une suspension monocellulaire. Ensuite, les EPDCs sont plaqués et cultivées dans un milieu contenant l’inhibiteur de kinase-5 ALK SB431542 pour maintenir leur phénotype épithélial EPDC. EMT est induite par la stimulation avec TGFβ. Cette méthode permet, pour la première fois, l’étude du processus de l’humain EMT épicardique dans un milieu contrôlé et permet de gagner plus de perspicacité dans la sécrétome de EPDCs qui peut aider la régénération cardiaque. Par ailleurs, cette approche uniforme permet une comparaison directe des comportements humains adultes et foetale épicardique.

Introduction

L’épicarde, une couche épithéliale monocellulaires qu’enveloppes le coeur, est d’une importance vitale pour le développement cardiaque et réparation (examinées par Smits et al. ¹). développemental, l’épicarde découle de l’orgue de proepicardial, une petite structure située à la base du cœur en voie de développement. Autour du jour du développement E9.5 à la souris et après la conception 4 semaines chez les humains, les cellules commencent à migrer à partir de cette structure de chou-fleur et de couvrir les pays en développement de myocarde². Une fois qu’une couche unique de cellules épithéliales est formée, une partie des cellules épicardiques subit épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT). Au cours de l’EMT, les cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales, comme les adhérences cellule-cellule et obtenir un phénotype mésenchymateux qui leur donne la capacité de migrer dans le myocarde en voie de développement. Les cellules formées de dérivée épicardiques (EPDCs) peuvent se différencier en plusieurs types de cellules cardiaques, y compris les fibroblastes, cellules musculaires lisses et potentiellement cardiomyocytes et cellules endothéliales³, bien que la différenciation de ces derniers, deux cellules les populations reste sujette à débat (examinée par Smits et al. ⁴). en outre, l’épicarde fournit des signaux paracrines instructif sur le myocarde pour réguler sa croissance et la vascularisation^5,6,7,8. Plusieurs études ont démontré qu’avec facultés affaiblies formation épicardique conduit à des anomalies du développement dans le muscle cardiaque^9,10, système vasculaire¹¹et conduction system¹², mettant l’accent sur l’essentiel contribution de l’épicarde à la formation du cœur.

Bien qu’en plein adulte l’épicarde est présent sous une couche dormante, il devient réactivé après ischémie¹³. Après lésion de réactivation épicardique reprend plusieurs des processus décrits pour le développement cardiaque, y compris la prolifération et EMT¹⁴, quoique moins efficacement. Fait intéressant, bien que le mécanisme exact n’est pas entièrement compris, la contribution épicardique de réparer peut être améliorée par un traitement avec, par exemple, thymosine β4¹⁵ ou modification ARNm de VEGF-A¹⁶, résultant en flexibilit cardiaque fonction après infarctus du myocarde. L’épicarde constitue donc une source intéressante de cellulaire pour améliorer la réparation endogène du cœur blessé.

Mécanismes du développement cardiaque sont souvent récapitulés lors de blessures, quoique de manière moins efficace. En quête d’activateurs épicardiques, il est primordial que nous pouvons déterminer et comparer la capacité totale de l’épicarde foetale et adulte. En outre, d’un point de vue thérapeutique, il est important que, en plus de l’expérimentation animale, nous étendons connaissance relativement à la réponse de l’épicarde humaine. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et adultes et foetales épicardiques dérivées des cellules humaines (EPDCs) dans une morphologie épithéliale-cellule-comme la culture et d’induire des EMT. Avec ce modèle, notre objectif est d’explorer et de comparer le comportement cellulaire épicardique adultes et du foetus.

Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de matériel épicardique humain, qui n’a pas été soigneusement étudiée. Ce qui est important, le protocole de culture décrit isolement et cellule fournit une seule méthode uniforme pour calculer les deux galets foetale et adultes EPDCs, permettant une comparaison directe entre les sources de ces deux cellules. En outre, étant donné que l’épicarde est isolée en fonction de son emplacement, il est assuré que les cellules sont en fait que dérivée¹⁷.

Tandis que des méthodes d’isolement EPDC humaines ont été établis précédemment, ces dépendent principalement de protocoles excroissance où des morceaux de tissu cardiaque ou épicardique sont plaqués sur une cellule culture plat^18,19. Cette approche sélectionne ainsi spécifiquement pour les cellules qui perdent partiellement leur phénotype épithélial afin de migrer, et qui sont plus susceptibles de subir une EMT spontanée. Dans le protocole actuel, l’épicarde est d’abord transformé en une solution de cellule unique qui permet à l’EPDCs isolés maintenir leur état épithélial. Cette méthode fournit donc un modèle solide en vitro afin d’étudier les EMT épicardique.

Protocole

Toutes les expériences avec des échantillons de tissus humains ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Leiden University Medical Center et est conforme à la déclaration d’Helsinki. Toutes les mesures sont effectuées avec du matériel stérile dans un flux de culture cellulaire du cabinet.

1. les préparatifs

1. Préparer EPDC milieu en mélangeant de Dulbecco mis à jour le milieu Eagle (DMEM basse-glucose) et milieu 199 (M199) dans un rapport 1:1. Ajouter 10 % chaleur inactivé sérum fœtal (SVF, chaleur inactivé pendant 25 min à 56 ° C) et compléter à 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL. Réchauffez le milieu EPDC dans un bain-marie à 37 ° C.
2. Réchauffez la trypsine 0.25%/EDTA (1:1) dans un bain-marie à 37 ° C.
3. Recouvrir les puits avec de la gélatine. Ajouter 0,1 % de gélatine/PBS dans chaque puits et incuber les boîtes pendant au moins 15 min à 37 ° C. Lignes directrices pour la plaque de culture cellulaire requis sont résumées dans le tableau 1. Retirez soigneusement tous les fluides avant ensemencement des cellules.
4. Préparer une solution de 10 mM SB431542 (SB), diluée dans le DMSO (CAUTION). Faire 50 µL d’extraits dans des tubes à centrifuger en polypropylène fond conique, comme des tubes Eppendorf et les stocker à-20 ° C. Notez que les parties aliquotes SB peuvent être décongelés qu’une seule fois.

2. récupération et stockage des spécimens adultes et foetal coeur

1. Stocker des oreillettes adultes humains directement après le retrait au cours de la chirurgie dans un tube de 50 mL à 15 mL haute-glucose DMEM contenant 10 % FBS, 100 U/mL de pénicilline et de streptomycine 100 mg/mL à 4 ° C. Les échantillons sont généralement 3-5 cm de taille et peut être conservés jusqu'à 48 h après dissection.
2. Stocker les coeurs foetaux issus de matériel de l’avortement électif dans EPDC milieu à 4 ° C jusqu'à 24h après l’isolement. Pour ce protocole, utilisez des échantillons à un âge gestationnel entre 12-22 semaines. Notez que le coeur entier peut être utilisé pour l’isolement de l’épicarde.

3. isolement de la couche épicardique

1. Dans le flux laminaire, préparer un plat de 100 mm-culture de cellules avec du PBS et placez une goutte de séparé (~ 200 µL) de PBS dans le couvercle. Remplir un tube de 15 mL avec support EPDC préchauffé 5 mL.
2. Placer le tissu dans le plat de culture cellulaire rempli avec du PBS. Assurez-vous que le tissu est imbibé fréquemment au cours de la procédure.
3. À l’aide d’un stéréomicroscope, enlevez autant de la couche épicardique de l’échantillon de tissu possible en elle décolle avec une pincette.
   Remarque : L’épicarde peut être reconnu comme une très mince couche transparente adhéré étroitement à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Essayez d’éviter une contamination par le tissu adipeux épicardique et les vaisseaux sanguins puisque cela entravera l’isolement.
4. Rassembler les morceaux de tissu épicardique dans la goutte de PBS sur le couvercle.
5. Couper le tissu épicardique en petits morceaux (0. 5 mm³) à l’aide d’un scalpel (Figure 1 b), ou le bout pointu des petites pinces. Notez que les pièces soient en mesure de passer une P1, 000 embout de la pipette (étape 3.6).
6. Ajouter 1 mL de la trypsine dans le tissu épicardique et collecter les pièces et la trypsine avec une P1, 000 embout de la pipette. Transvaser le tissu dans un tube à centrifuger conique de 1,5 mL (Figure 1).
7. Incuber le tube dans un bain-marie à 37 ° C pendant 10 min, en agitant à ~ 60 tr/min.
8. Retirer le tube de l’eau du bain et nettoyer l’extérieur du tube avec l’éthanol à 70 %.
9. Laisser le tissu à couler au fond du tube (Figure 1) et transvaser avec soin le surnageant contenant les cellules épicardiques dans le tube de 15 mL contenant 5 mL de milieu de EPDC pour inactiver la trypsine.
10. Reconstituer le tissu restant dans le tube à centrifuger conique avec la trypsine 1 mL et mélanger doucement pipetage de haut en bas.
11. Répétez l’étape 3.7 à 3.10 deux fois. À l’étape finale, après un total de 30 min d’incubation de la trypsine, transfert tant le surnageant et le tissu épicardique restant dans le tube contenant le milieu EPDC.
12. Lorsque toutes les cellules sont collectées dans un milieu EPDC, doucement passer la suspension par une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 19 dans un nouveau tube de 15 mL de dissocier mécaniquement les cellules (Figure 1E).
    Remarque : Assurez-vous d’homogénéiser la suspension par pipetage de haut en bas avant de passer la solution à travers l’aiguille afin d’empêcher l’aiguille s’obstruée.
13. Pour davantage de dissocier les cellules, répétez l’étape 3.12 avec une aiguille de calibre 21.
14. Placez une passoire de cellule de 100 µm au sommet d’un tube de 50 mL et transférer le support contenant les cellules épicardiques sur la crépine à l’aide d’une pipette de 10 mL pour enlever toutes les touffes restants (Figure 1F).
15. Laver le filtre pour recueillir des cellules résiduelles en pipettant également, 5 mL de milieu de EPDC sur la crépine.
16. Pipette de la suspension cellulaire du tube de 50 mL dans un tube de 15 mL. Étant donné que les cellules se déposent au fond du tube, secouez légèrement la solution avant de pipetage.
    Remarque : Cette étape n’est pas nécessaire, un tube plus petit sida visualisation du culot après centrifugation.
17. Centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (Figure 1).
18. Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire (Figure 1 H) dans le volume requis de EPDC support (tableau 1).
    Remarque : Pour EPDCs fœtales, utilisez directement moyen EPDC contenant 10 µM de l’inhibiteur de kinase de ALK5 (EPDC + SB). Les cellules adultes peuvent être plaqués sans SB lors du premier passage.
19. Plaque de la suspension cellulaire sur les plaques de culture de gélatine enduit (Figure 1I). La taille du puits dépend de la taille de l’échantillon de tissu épicardique (tableau 1). Notez que confluence basse va entraîner l’apparition de l’EMT.
20. Placer les cellules dans un incubateur pendant au moins 48 h à 37 ° C, 5 % de CO₂ pour permettre les cellules fixer sur la plaque de culture.

4. culture de EPDCs

1. Reconstituer le milieu EPDC + SB au moins tous les 3 jours.
2. Inspecter les cellules au moins tous les 3 jours à l’aide du microscope. Lorsque les cellules atteignent la confluence, c'est-à-direlorsque la plaque de culture est entièrement recouverte de cellules, le passage des cellules dans un rapport de 1:2 de surface. Notez que pour atteindre confluence peut prendre environ 5 à 10 jours.
   1. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette ou un système d’aspiration avec, par exemple, une pipette de verre.
   2. Laver soigneusement les cellules en ajoutant des PBS aux cellules. Doucement agiter la plaque et aspirer le PBS.
   3. Ajouter la trypsine à la plaque. Tourner délicatement la plaque pour couvrir toutes les cellules avec de la trypsine et incuber la plaque pendant 1 min à 37 ° C.
      NOTE : Utiliser comme trypsine peu possible (indication : 200 µL / puits d’une 6 bien sur plaque)
   4. Taper la plaque pour détacher mécaniquement les cellules de la partie inférieure de la plaque. Utiliser le microscope pour vérifier visuellement si les cellules ont détaché. Si ce n’est pas le cas, incuber la plaque de culture cellulaire pendant une minute supplémentaire.
   5. Ajouter le volume requis de EPDC + SB milieu aux cellules, resuspendre par pipetage de haut en bas et transférer la suspension cellulaire à une nouvelle plaque de culture enduit de gélatine.
      Remarque : en général, les cellules peuvent être conservés dans une morphologie pavées jusqu'à passage 8.

5. l’induction de l’EMT dans EPDCs

1. Pour provoquer l’EMT, dissocier les cellules avec la trypsine et transfert les cellules à la gélatine de nouveaux enduits de puits dans un rapport de 1:2 surface dans un milieu EPDC + SB, comme décrit dans 4 et incuber pendant au moins 24 h à 37 ° C, 5 % de CO₂.
2. Vérifiez si confluency est 50-70 %, et si EPDCs ont une morphologie de pavés.
   Remarque : Confluence affecte l’aptitude des EPDCs EMT.
3. Aspirer le milieu des cellules et laver les cellules soigneusement avec du PBS (Voir l’étape 4.2.1 - 4.2.2).
4. Stimuler les cellules avec 1 ng/mL TGFβ3 dans un milieu EPDC et placez-les dans un incubateur à 37 ° C, 5 % CO₂ pendant 5 jours. Notez que pendant la stimulation, le milieu EPDC contenant du TGFβ3 n’a pas à être réapprovisionné.
5. Contrôler les cellules au quotidien. Après 5 jours, les cellules qui ont subi les EMT sont reconnus par une morphologie fusiforme (Figure 2 a).
6. La culture fusiformes EPDCs selon la méthode décrite dans 4 sans addition de SB ou TGFβ au milieu EPDC. Notez qu’en général, EPDCs fusiformes peuvent être cultivées jusqu'à passage 20.
7. Valider la présence de l’EMT avec immunofluorescence à l’aide d’anticorps contre les marqueurs mésenchymateux αSMA ou la vimentine ou par la phalloïdine pour détecter la formation de fibres de stress d’actine F (Figure 2 b), ou qRT-PCR pour les gènes liés à l’EMT ( par exemple, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-cadhérine, MMP3, escargot, limace) (Figure 2 et tableau 2).

Résultats

Ici, nous exposons un protocole simple pour isoler EPDCs des adult et du foetus humain tissu cardiaque (Figure 1). Ce protocole tire parti de l’emplacement facilement accessible de l’épicarde à l’extérieur du cœur (Figure 1 a). Coloration de l’oreillette cardiaque après que dissection montre que l’épicarde WT1 + est supprimé tandis que le sous-épicardique sous-jacente de la matrice extracellulaire et le tissu my...

Discussion

Nous décrivons ici un protocole détaillé d’isoler et de la culture des cellules primaires épicardiques dérivés de coeurs adultes et du foetus humains. Une caractérisation de ces cellules a été précédemment publié¹⁷. Nous avons montré que les deux types de cellules peuvent être maintenues tant que les cellules épithéliales de pavées comme lorsqu’il est cultivé avec l’inhibiteur de kinase de ALK5 SB431542. EMT est partie intégrante du épicardique activation in vivo...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083