人成体和胎心标本中原发性心外膜细胞的分离培养

摘要

心外膜在心脏的发育和修复中起着至关重要的作用, 它为心肌壁提供细胞和生长因子。在这里, 我们描述了一种培养人原发性心外膜细胞的方法, 能够对它们的发育和成人特征进行研究和比较。

摘要

心外膜是一种覆盖心肌的上皮细胞层, 在心脏发育过程中, 以及在缺血性损伤后心脏的修复反应中具有重要作用。当激活时, 心外膜细胞经历了称为上皮间质转移的过程, 为再生心肌提供细胞。此外, 心外膜通过分泌基本的分泌因子而做出贡献。为了充分了解心外膜的再生潜能, 需要一个人类细胞模型。在这里, 我们概述了一个新的细胞培养模型, 从人类成年和胎儿心脏组织中提取原发性心外膜衍生细胞 (EPDCs)。为了分离 EPDCs, 心外膜从心脏标本的外部进行解剖, 并处理成单个细胞悬浮。其次, EPDCs 被镀和培养在 EPDC 培养基含有5激酶抑制剂 SB431542 保持其上皮表型。TGFβ刺激诱发急诊。这种方法首次能够在控制的环境中对人心外膜急诊的过程进行研究, 并有助于在 EPDCs 的 secretome 中获得更多的洞察力, 从而有助于心脏再生。此外, 这种统一的方法可以直接比较成人和胎儿的心外膜行为。

引言

心外膜, 一个单细胞上皮层, 信封心脏, 是至关重要的心脏发育和修复 (在史密特et 。¹). 发育, 心外膜产生于 proepicardial 器官, 一个小结构位于发展的心脏基地。在发展天 E9.5 在老鼠和4星期以后构想在人, 细胞开始从这个花椰菜结构迁移并且包括开发的心肌²。一旦形成单个上皮细胞层, 心外膜细胞的一部分就会进行上皮间质的转移 (急诊室)。在急诊室, 细胞失去了上皮特征, 如细胞粘连, 并获得一个间充质表型, 使他们有能力迁移到发展中的心肌。经形成的心外膜衍生细胞 (EPDCs) 可分化为多种心肌细胞类型, 包括成纤维细胞、平滑肌细胞和潜在心肌细胞和内皮干细胞³, 虽然后两个细胞的分化人口仍需进行辩论 (在史密特等) 中进行审查。⁴). 此外, 心外膜提供了指导分泌信号的心肌调节其生长和血管化^5,6,7,8。多项研究表明, 心外膜形成受损导致心肌发育缺陷^9,10, 血管¹¹, 传导系统¹², 强调至关重要的心外膜对心脏形成的贡献。

虽然在成人心脏心外膜是存在作为休眠层数, 它在缺血¹³以后变得激活。心外膜重新激活损伤后概括为心脏发育, 包括增殖和急诊¹⁴所描述的几个过程, 尽管效率较低。有趣的是, 虽然确切的机制还没有完全理解, 但通过治疗可以改善心外膜对修复的贡献,例如, 胸腺素β4¹⁵或修改 VEGF-mRNA¹⁶, 从而改善心脏心肌梗死后功能。因此, 心外膜被认为是一个有趣的细胞来源, 以加强内源性修复受伤的心脏。

心脏发育的机制经常概括在损伤期间, 虽然以一种较不有效的方式。为了寻找心外膜激活剂, 我们可以确定和比较胎儿和成人心外膜的全部容量, 这是至关重要的。此外, 从治疗的角度来看, 重要的是, 除了动物实验外, 我们还要对人类心外膜的反应提供知识。在这里, 我们描述了一种方法, 以分离和培养人成体和胎儿心外膜衍生细胞 (EPDCs) 在上皮细胞样的形态学和诱发急诊。本模型旨在探讨和比较成人和胎儿心外膜细胞的行为。

该协议的主要优点是使用了人的心外膜材料, 尚未深入研究。重要的是, 所描述的隔离和细胞培养协议提供了一个统一的方法来获得胎儿和成人鹅卵石 EPDCs, 使这两个细胞来源的直接比较。此外, 由于心外膜是根据其位置隔离的, 因此确保单元格实际上是 epicardially 派生的¹⁷。

虽然以前已经建立了人类的 EPDC 隔离方法, 但它们大多依赖于将心脏或心外膜组织镀到细胞培养皿^18,19的生长协议。这种方法可以专门为部分丧失其上皮表型的细胞进行移植, 更容易接受自发的急诊急救。在当前的协议中, 心外膜首先被处理成一个单一的细胞溶液, 允许隔离的 EPDCs 保持其上皮状态。因此, 该方法提供了一个固体的体外模型来研究心外膜急诊。

研究方案

所有人体组织标本的实验均由莱顿大学医学中心伦理委员会批准, 并符合赫尔辛基宣言。所有步骤都用无菌设备在细胞培养流柜中进行。

1. 筹备工作

1. 在1:1 的比例下, 将 Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM 低葡萄糖) 和中 199 (M199) 混合, 制备 EPDC 培养基。添加10% 热灭活胎牛血清 (血清, 热灭活25分钟在56摄氏度), 并补充 100 U/毫升青霉素和100毫克/毫升链霉素。预热的 EPDC 介质在37°c 水浴。
2. 预热胰蛋白酶 0.25%/EDTA (1:1) 在37°c 水浴。
3. 用明胶涂水井。将0.1% 的明胶/PBS 添加到每一个井中, 在37摄氏度时至少15分钟孵化出板材。在表 1中总结了所需的单元格区域性板的准则。在电镀细胞之前小心地去除所有液体。
4. 准备一个10毫米 SB431542 (锑) 的库存溶液, 稀释在亚砜 (谨慎)。使50µL 整除数在锥形底部聚丙烯离心管, 如离心管, 并存储在-20 摄氏度。请注意, 某人整除数只能解冻一次。

2. 成人和胎儿心脏标本的检索和贮存

1. 在50毫升的15毫升高葡萄糖 DMEM 的外科手术中, 直接储存成人耳部, 含10% 只血清, 100 毫升青霉素, 100 毫克/毫升链霉素, 4 摄氏度。标本一般 3-5 厘米的大小, 可以储存最多48小时后解剖。
2. 储存胎儿心脏从选择性流产材料获得的 EPDC 培养基在4°c, 24 小时后隔离。对于本协议, 请在 12-22 周之间使用妊娠期样本。请注意, 整个心脏可以用来隔离心外膜。

3. 心外膜层的隔离

1. 在层流柜中, 用 pbs 准备一个100毫米的细胞培养皿, 并在盖子上放置一个单独滴 (~ 200 µL) 的 pbs。填充15毫升管与5毫升预热 EPDC 培养基。
2. 将组织放在充满 PBS 的细胞培养皿中。在手术过程中要确保组织经常湿润。
3. 使用显微镜, 从组织样本中取出尽可能多的心外膜层, 用镊子将其剥离。
   注意: 心外膜可以被识别为非常薄, 透明的层紧密附着在心脏的外部 (图 1A)。尽量避免与心外膜脂肪组织和血管的污染, 因为这将阻碍隔离。
4. 在盖上的 PBS 液滴上收集心外膜组织的部分。
5. 使用手术刀 (图 1B) 将心外膜组织切成小块 (0.5 毫米³), 或者使用小钳的锋利尖。请注意, 这些片断应该能够通过 P1,000 吸管提示 (步骤 3.6)。
6. 将1毫升的胰蛋白酶加入到心外膜组织中, 用 P1,000 吸管尖端收集切片和胰蛋白酶。将组织转移到1.5 毫升锥形离心管 (图 1C)。
7. 在37摄氏度的水浴中孵化出10分钟的管子, 同时晃动在60转每分钟。
8. 从水浴中取出管子, 用70% 乙醇清洗管子的外部。
9. 允许组织下沉到管的底部 (图 1D), 并小心地将含有心外膜细胞的上清液转移到含有5毫升 EPDC 培养基的15毫升管中, 以使胰蛋白酶失效。
10. 用1毫升胰蛋白酶补充锥形离心管中剩余的组织, 并通过轻轻吹打上下混合。
11. 重复步骤3.7 至3.10 两次。在最后一步, 在总共30分钟的胰蛋白酶孵化后, 将上清和其余的心外膜组织转移到含有 EPDC 培养基的管内。
12. 当所有细胞以 EPDC 培养基收集时, 通过10毫升的注射器轻轻地将悬浮液通过一个19口径的针头插入一个新的15毫升管, 机械地分离细胞 (图 1E)。
    注: 在通过针头通过溶液前, 一定要融汇吹打的悬浮液, 以防止针头被堵塞。
13. 要进一步离解细胞, 重复步骤3.12 与21口径针。
14. 将100µm 细胞过滤器放在50毫升管的顶部, 用10毫升吸管将含有心外膜细胞的培养基转移到滤网上, 以除去所有剩余的团簇 (图 1F)。
15. 通过吹打5毫升 EPDC 培养基将过滤器清洗到过滤器上以收集残余细胞。
16. 吸管细胞悬浮从50毫升管变成15毫升管。由于细胞下沉到管底部, 在吹打前轻轻摇动溶液。
    注意: 虽然这一步是不必要的, 一个较小的管有助于可视化颗粒后离心。
17. 离心机在室温下为 200 x 克5分钟 (图 1G)。
18. 在 EPDC 介质 (表 1) 的所需卷中, 移除上清和并用重悬单元格颗粒(图 1H)。
    注: 对于胎儿 EPDCs, 直接使用含有10µM ALK5 激酶抑制剂 (EPDC + 锑) 的 EPDC 培养基。在第一段中, 成人细胞在没有某人的情况下可以被电镀。
19. 板上的细胞悬浮在明胶涂层培养板 (图 1I)。井的大小取决于心外膜组织样本的大小 (表 1)。注意低融合会诱发急诊的发生。
20. 将单元格放在孵化器中至少48小时, 在37摄氏度, 5% CO₂ , 以允许单元格附加到培养板上。

4. EPDCs 文化

1. 至少每3天补充一次 EPDC。
2. 使用显微镜至少每3天检查一次细胞。当单元格达到融合时,即, 当培养板完全覆盖单元格时, 通过1:2 表面比的单元格。请注意, 到达融合可能需要 5-10 天。
   1. 使用吸管或吸入系统 (如, 例如) 将玻璃吸管吸出介质。
   2. 通过将 PBS 添加到细胞中, 仔细冲洗细胞。轻轻地旋转盘子, 吸入 PBS。
   3. 在盘子里加入胰蛋白酶。用胰蛋白酶轻轻旋转盘子覆盖所有细胞, 在37摄氏度时将板材孵化1分钟。
      注: 尽可能少使用胰蛋白酶 (指示: 200 µL 每井6井板)
   4. 轻敲盘子, 机械地从盘子的底部分离出细胞。使用显微镜目视检查细胞是否已分离。如果没有, 孵化细胞培养板多一分钟。
   5. 将所需的 EPDC + 锑培养基添加到细胞中, 并用重悬吹打向上和向下, 并将细胞悬浮液转移到新的明胶涂层培养板上。
      注意: 一般情况下, 细胞可以保持在鹅卵石形态, 直至8。

5. 在 EPDCs 中诱导急诊医师

1. 为了诱导急诊医师, 将细胞与胰蛋白酶分离, 将细胞转移到 EPDC + 锑培养基中1:2 表面比的新明胶涂层井, 如4所述, 在37摄氏度、5% CO₂上孵育至少24小时。
2. 检查融合是否为 50-70%, 如果 EPDCs 有鹅卵石形态。
   注意: 融合影响 EPDCs 接受急诊医师的能力。
3. 从细胞中吸取培养基, 用 PBS 仔细冲洗细胞 (见步骤 4.2.1-4.2.2)。
4. 在 EPDC 培养基中刺激 1 TGFβ3/毫升的细胞, 并将它们放在孵化器中37摄氏度, 5% CO₂ 5 天。注意, 在刺激过程中, 不需要补充含有 TGFβ3的 EPDC 培养基。
5. 每天监视单元格。5天后, 接受急诊的细胞由纺锤形形态学 (图 2A) 识别。
6. 培养纺锤形 EPDCs 根据4描述的方法, 不添加某人或 TGFβ到 EPDC 培养基。请注意, 一般情况下, 主轴形状的 EPDCs 可以培养到20通道。
7. 用抗体对间充质标志物αSMA 或波形或罗丹明检测 F 肌动蛋白应激纤维 (图 2B) 的形成, 或使用 qRT PCR 技术对急诊患者相关基因进行免疫荧光染色, 验证其发生情况 (例如, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, n-钙黏蛋白, MMP3, 蜗牛, 蛞蝓) (图 2C和表 2)。

结果

在这里, 我们概述了一个简单的协议, 以隔离 EPDCs 从人类成人和胎儿心脏组织 (图 1)。此协议利用心外膜在心脏外部的易于访问的位置 (图 1A)。解剖后的心耳廓染色表明, WT1+ 心外膜被删除, 而基础心外膜下细胞外基质和心肌组织保持不变 (图1J)。以前已经进行了广泛的描述, 表明 EPDCs 表达的心外膜标记,?...

讨论

在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以隔离和培养从人类成年和胎儿心脏的原发性心外膜细胞。这些单元格的广泛描述以前已发布¹⁷。我们已经表明, 两种细胞类型可以保持作为上皮鹅卵石样细胞, 当培养与 ALK5 激酶抑制剂 SB431542。在发育和损伤后反应过程中, 急诊急救是心外膜激活的体内的一个组成部分。通过添加 TGFβ, 可以对急诊医师进行研究。重要的是, 我们以前观察...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083