분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

요약

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

초록

Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.

서문

Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 ¹).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근²를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포³를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 ⁴). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization^5,6,,78심근에 교육적 paracrine 신호를 제공 한다. 여러 학문은 장애인된 epicardial 형성 발달 결함 심장 근육^9,10, 맥 관 구조¹¹및 전도 시스템¹², 필수 강조에 리드 설명 했다 심장의 형성에 epicardium의 기여 금.

성인 심장에는 epicardium 휴면 레이어로 있으면, 비록 그것은 허 혈¹³시 다시 활성화 된다. Epicardial 다시 활성화 후 상해의 몇몇이 프로세스 심장 개발을 위한 확산 및 응급¹⁴, 이기는 하지만 설명 덜 효율적으로. 흥미롭게도, 비록 정확한 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 복구 epicardial 기여와 함께, 예를 들어, Thymosin β4¹⁵ 처리에 의해 향상 시킬 수 있습니다 또는 mRNA VEGF A¹⁶, ameliorated 심장에 결과 수정 심근 경색 후 함수입니다. epicardium 따라서 부상된 심장의 내 생 수리를 강화 하는 재미 있는 셀 소스를 여겨진다.

심장 개발의 메커니즘은 덜 효율적인 방식 상해, 동안 자주 지는. Epicardial 활성 검색 확인 하 고 태아 및 성인 epicardium의 전체 용량을 비교할 수 있습니다 우리가 최고입니다. 또한, 치료 관점에서, 동물 실험, 뿐만 아니라 우리 인간의 epicardium의 응답에 관한 지식을 확장 중요 하다. 여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)는 상피 세포 같은 형태학에 문화를 격리 하 고 구급 대를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델을 우리는 탐구 하 고 성인과 태아 epicardial 셀 동작 비교 목표로 합니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 철저 하 게 공부 하지는 인간의 epicardial 물자의 사용 이다. 중요 한 것은, 설명된 절연 및 세포 문화 프로토콜 두 태아 및 성인 자갈 EPDCs, 이러한 두 셀 소스 사이 직접적인 비교를 사용 하면 파생 단일 유니폼 방법의 제공 한다. 또한, 이후는 epicardium 격리 된 위치에 따라, 그것은 셀 실제로 epicardially 파생된¹⁷는 보장 된다.

인간의 EPDC 격리 방법을 이전 설립 되었습니다,이 주로 심장 또는 epicardial 조직의 조각 셀 문화 접시^18,19에 도금는 파생물 프로토콜에 의존. 이 방법은 그로 인하여 세포는 부분적으로 마이그레이션하려면, 그들의 상피 표현 형을 잃고 그리고 자발적인 응급 수술 하는 경향이 더 위해 특별히 선택 합니다. 현재 프로토콜에서은 epicardium 상피 상태로 유지 하기 위해 고립 된 EPDCs를 허용 하는 단일 셀 솔루션으로 먼저 처리 됩니다. 이 메서드는 따라서 epicardial 응급 연구 단단한 체 외에 모델을 제공 합니다.

프로토콜

인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.

1입니다. 준비

1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.
2. 미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.
3. 젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.
4. 재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브, Eppendorf 관 처럼 50 µ L aliquots 참고 SB aliquots는 한 번만 해빙 될 수 있습니다.

2. 검색 및 성인 및 태아 심장 표본 저장

1. 수술 시 제거 시 직접 인간 성인 auricles 15 mL 50 mL 튜브에 저장 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 4 ° c.에 100 mg/mL 스 포함 된 높은 포도 당 DMEM 샘플은 일반적으로 3-5 cm 크기에서 및 최대 저장 될 수 있다 해 부 후 48 h.
2. 격리 후 24 h까지 4 ° C에서 EPDC 매체에서 선택 낙태 자료에서 얻은 태아 마음을 저장 합니다. 이 프로토콜에 대 한 샘플을 사용 하 여 12 월 22 일 주 사이 임신 나이. 참고 전체 심 혼은 epicardium의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다.

3입니다. 절연 Epicardial 계층의

1. 층 류 캐비닛에 PBS 가진 100 m m 세포-배양 접시를 준비 하 고 뚜껑에 PBS의 별도 작은 물방울 (~ 200 µ L)를 배치 합니다. 5 mL 미리 데워 진된 EPDC 매체에 15 mL 튜브를 채우십시오.
2. 장소 세포 배양 접시에 조직 PBS 가득합니다. 조직 절차 동안 자주 습 하 게 다는 것을 확인 하십시오.
3. 집게를 사용 하 여 그것을 벗 하 여 가능한 조직 샘플에서 epicardial 계층의 제거는 stereomicroscope를 사용 하 여.
   참고:로 매우 얇고, 투명 한 레이어는 밀접 하 게 심장 (그림 1A)의 바깥쪽에 준수는 epicardium은 인식할 수 있습니다. 이 격리를 방해 합니다 때문 epicardial 지방 조직 및 혈관으로 오염을 방지 하려고 합니다.
4. 뚜껑에 PBS의 물방울에 epicardial 조직의 조각을 수집 합니다.
5. (그림 1B), 메스를 사용 하 여 또는 작은 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 작은 조각 (0.5 m m³)으로 epicardial 조직을 잘라. 조각을 P1, 전달할 수 있어야 합니다 참고 000 피펫으로 팁 (단계 3.6).
6. 1 mL의 트립 신 epicardial 조직에 추가 하 고 조각 및 p1, 000 피펫으로 팁 트립 신 수집. 조직 1.5 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (그림 1C)로 전송 합니다.
7. ~ 60 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.
8. 물 탕에서 튜브를 제거 하 고 70% 에탄올 튜브의 외부를 청소.
9. (그림 1D) 관의 바닥에 침 몰 하 고 신중 하 게 상쾌한 비활성화는 트립 신을 5 mL EPDC 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 epicardial 셀을 포함 하는 조직을 허용.
10. 1 mL의 트립 신와 원뿔 원심 분리기 튜브에 남아 있는 조직을 보충 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
11. 3.7 3.10 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 단계에서 트립 신 보육의 30 분의 총 후 전송는 상쾌한 고 나머지 epicardial 조직 EPDC 매체를 포함 하는 관으로.
12. 모든 세포는 EPDC 매체에 수집 되는 경우 부드럽게 통과 정지 10 mL 주사기 19-게이지 바늘으로 세포 (그림 1E) 기계적으로 해리를 새로운 15 mL 튜브에.
    참고: 방해 지 고 바늘을 방지 하기 위해 바늘을 통해 솔루션을 전달 하기 전에 아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 있는지 확인 합니다.
13. 더 세포 분열, 21-게이지 바늘 3.12 단계를 반복 합니다.
14. 100 µ m 셀 거르는 50 mL 튜브 위에 놓고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 덩어리 (그림 1 층)을 제거 하는 여과기에 epicardial 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.
15. 5 mL EPDC 매체는 여과기에 pipetting 여 잔여 세포를 수집 여과기를 세척.
16. 피펫으로 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 50 mL 튜브에서. 이후 셀 튜브의 바닥에 침 몰, pipetting 전에 솔루션 부드럽게 흔들어.
    참고:이 단계는 필요 하지, 하는 동안 작은 튜브 원심 분리 후 펠 릿의 시각화를 에이즈.
17. 실내 온도 (그림 1G)에 5 분 동안 200 x g에서 원심.
18. 상쾌한을 제거 하 고 필요한 양의 EPDC 매체 (표 1)에 셀 펠 릿 (그림 1 H) resuspend.
    참고: 태아 EPDCs 직접 ALK5 키 니 아 제 억제 물 (EPDC + SB)의 10 µ M를 포함 하는 EPDC 매체를 사용 합니다. 성인 세포 첫 대목 중 SB 없이 도금 될 수 있다.
19. 세포 현 탁 액에 젤라틴 코팅 배양 배지 (그림 1I) 접시 우물의 크기는 epicardial 조직 샘플 (표 1)의 크기에 따라 달라 집니다. 참고 낮은 confluency 응급의 발생을 유발 한다.
20. 37 ° c, 5% CO₂ 문화 접시에 연결할 셀 수 있도록 적어도 48 h에 대 한 인큐베이터에 셀을 놓습니다.

4입니다. EPDCs의 문화

1. EPDC + SB 매체 매 3 일 보충.
2. 적어도 3 일 마다 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 셀 도달 하면 confluency, 즉, 문화 접시 셀으로 완전히 덮여 때, 통로 표면 비율 1: 2에에서 셀. Note confluency 도달 ~ 5-10 일을 걸릴 수 있습니다.
   1. 매체와 함께, 예를 들면, 유리 피펫으로 피펫으로 또는 포부 시스템을 사용 하 여 발음
   2. 세포를 PBS를 추가 하 여 셀을 신중 하 게 씻어. 부드럽게 접시 소용돌이 PBS 발음.
   3. 접시에 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 회전 하는 트립 신으로 모든 세포를 커버 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 접시를 품 어 접시
      참고: 사용 가능한 작은 트립 신으로 (표시: 6의 당 200 µ L 잘 플레이트)
   4. 접시 접시의 아래쪽에서 세포를 기계적으로 분리를 누릅니다. 현미경을 사용 하 여 시각적으로 세포 분리가 확인. 그렇지 않으면, 추가 분에 대 한 셀 문화 접시를 품 어.
   5. 셀에 EPDC + SB 매체의 필요한 볼륨을 추가 하 고 아래로, pipetting으로 resuspend 새로운 젤라틴 코팅 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송.
      참고: 일반적으로, 세포 수에 보관 통과 8까지 조약돌 형태학.

5입니다. EPDCs 구급 대의 유도

1. 세계로 유도 하 trypsin 및 전송 새로운 젤라틴을 셀 4에 설명 된 대로 EPDC + SB 매체에서 표면 비율 1:2 웰 스를 코팅 하 고 37 ° C, 5% CO₂에서 적어도 24 h에 대 한 품 어 세포 분열.
2. 확인 경우 confluency은 50-70% 그리고 EPDCs 조약돌 형태학입니다.
   참고: Confluency 응급을 EPDCs의 능력을 영향을 줍니다.
3. 세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 PBS와 세포 세척 (단계 4.2.1-참조 4.2.2).
4. 1 ng/mL TGFβ3 EPDC 매체에와 세포를 자극 하 고 37 ° c, 5% CO₂ 5 일 동안 인큐베이터에 넣어. 참고는 자극, 동안 포함 하는 TGFβ3 EPDC 매체 필요가 없습니다 보충 되어야 합니다.
5. 셀을 매일 모니터링 합니다. 5 일 후 응급 수술 하는 셀은 스핀 들 모양의 형태 (그림 2A)에 의해 인식 됩니다.
6. 문화 스핀 들-모양 EPDCs EPDC 매체에 SB 또는 TGFβ의 추가 없이 4에서 설명 하는 방법. 일반적으로, 스핀 들-모양 EPDCs는 통로 20까지 양식 수 있습니다.
7. Immunofluorescent 얼룩과 응급 발생 확인 F-말라 스트레스 섬유 (그림 2B)의 형성을 검출 하기 위하여 엽 마커 αSMA 또는 Vimentin 또는 phalloidin에 의해 항 체를 사용 하 여 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 응급 관련 유전자 ( 에 대 한 예를 들어, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, 달팽이, 민 달팽이) (그림 2C 와 표 2).

결과

여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 ...

토론

여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시¹⁷이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다....

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Gibco	31150-022
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Trypsin 0.25%	Invitrogen	25200-056
Penicillin G sodium salt	Roth	HP48
Streptomycin sulphate	Roth	HP66
Trypsin 1:250 from bovine pancreas	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Culture plates 6 well	Greiner bio-one	657160
Culture plates 12 well	Corning	3512
Culture plates 24 well	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Merck	102931
100-1000µL Filtered Pipet Tips	Corning	4809
10-ml pipet	Greiner bio-one	607180
5-ml pipet	Greiner bio-one	606180
Cell culture dish 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	Or home-made and sterilized
Eppendorf tubes 1.5 mL	Eppendorf	0030120086
15-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	188271
50-ml centrifuge tubes	Greiner bio-one	227261
10 mL Syringe	Becton Dickinson	305959
Needles 19 Gauge	Becton Dickinson	301700
Needles 21 Gauge	Becton Dickinson	304432
EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm	Greiner bio-one	542000
TGFβ3	R&D systems	243-B3
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379
Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipet P1,000	Gilson	F123602
Pipet controller	Integra	155 015
Stereomicroscope	Leica	M80
Inverted Light Microscope	Olympus	CK2
Centrifuge	Eppendorf	5702
Waterbath	GFL	1083