إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

Summary

يوضح هذا المقالة مبادئ حقن سريعة، وكسبها من الفلورسنت المجهرية الدقيقة في circulatory system الأسماك الصغيرة والتصور في فيفو من المجهرية الدقيقة في دم الأسماك.

Abstract

ويمكن تطبيق الإدارة النظامية للجسيمات الصغيرة الحجم في حي للتصور المفرج، العقاقير واللقاحات، زرع الخلايا المحورة وراثيا وأجهزة الاستشعار البصرية صغيرة. ومع ذلك، ميكروينجيكشنز عن طريق الحقن الوريدي في الحيوانات الصغيرة، والتي تستخدم في الغالب في المختبرات البيولوجية والبيطرية، صعبة جداً وتتطلب موظفين مدربين. هنا، نحن تثبت طريقة قوية وفعالة لإدخال المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية للكبار الزرد (دانيو rerio) بحقن في الكلي الأسماك. تصور المجهرية الدقيقة أدخلت في المفرج، نقترح تقنية تصوير إينترافيتال بسيطة في الخياشيم السمكية. في فيفو رصد درجة الحموضة الدم الزرد كان إنجازه باستخدام الفلورية المغلف حقن التحقيق، سنارف-1، لإثبات واحدة من التطبيقات الممكنة لوصف تقنية. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً لتغليف صبغة حساسة لدرجة الحموضة ويوضح مبادئ حقن سريعة والتصور كبسولات رقيقة جداً التي تم الحصول عليها في فيفو تسجيل إشارة الفلورسنت. تتميز الطريقة المقترحة لحقن بمعدل وفيات منخفض (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما. يمكن تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في أنواع الأسماك الصغيرة الأخرى، مثل أسماك الغابى والميداكا.

Introduction

إدارة الجسيمات الصغيرة الحجم في جسم حيوان مهمة هامة في مجالات مثل المخدرات و تسليم اللقاحات¹والمفرج التصور²و زرع الخلايا المحورة وراثيا³وزرع أجهزة الاستشعار البصرية صغيرة ^{4 , 5}-إجراءات غرس جسيمات microscale في نظام الأوعية الدموية في الحيوانات المختبرية الصغيرة غير صعبة، خاصة بالنسبة للكائنات المائية الحساسة. لعينات البحث شعبية مثل الزرد، فإنه ينصح أن يكون توضيح هذه الإجراءات باستخدام بروتوكولات الفيديو.

ميكروينجيكشنز إينتراكاردياك والشعرية تتطلب موظفين مدربين ومرافق الجراحة فريدة لتقديم ميكروبجيكتس في الدم الزرد. سابقا، قد اقترح حقن يدوي الرجعية-المداري³ كطريقة سهلة وفعالة لإدارة كل الخلايا. ومع ذلك، في تجربتنا، بسبب صغر مساحة الشبكة الشعرية العين، يستغرق الكثير من الممارسات لتحقيق النتيجة المرجوة من هذا الأسلوب.

هنا، نحن تصف طريقة لغرس يمثل قوية وفعالة في نظام الدورة الدموية عن طريق الحقن اليدوي مباشرة في أنسجة الكلي الزرد الكبار، وغنية بالشعيرات الدموية والأوعية الكلوية. يستند هذا الأسلوب على البروتوكول الفيديو لزرع الخلايا في الكلي الزرد⁶، ولكن تم القضاء على الخطوات microsurgical مؤلمة وتستغرق وقتاً طويلاً. الطريقة المقترحة تتسم بانخفاض معدل الوفيات (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما.

جزء هام من البروتوكول المقترح هو التصور من مزروع المجهرية الدقيقة (إذا كانوا الفلورسنت أو الملونة) في الشعيرات الدموية الخيشومية، مما يسمح لتحقق نوعية الحقن، وإجراء تقييم نسبي تقريبي لعدد حقن الجسيمات، والكشف عن إشارة الطيفية للقياسات الفسيولوجية مباشرة من الدم الجائل. كمثال للتطبيقات الممكنة لوصف تقنية، نبدي البروتوكول في فيفو قياسات pH دم الزرد استخدام مجس فلورسنت المغلف، سنارف-1، اقترح أصلاً في بورفينسكايا وآخرون. 2017⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

جميع الإجراءات التجريبية أجريت وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات، ووافق عليها "الحيوان مواضيع البحوث اللجنة من معهد علم الأحياء" في إركوتسك جامعة ولاية.

1-تصنيع كبسولات رقيقة جداً

ملاحظة: تعد كبسولات رقيقة جداً تحمل صبغة فلورسنت استخدام جمعية طبقة بطبقة مكونة من^7،بولييليكتروليتيس المشحونة معاكس⁸. وأجريت جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة.

1. لتوليف المسامية ميكروكوريس₃ كربونات أرفق صبغة الفلورسنت، مزيج 2 مل الحل سنارف-1-ديكستران (يمكن استخدام معظم صبغة الفلورسنت البوليمر زمنياً مثل فيتك-جيش صرب البوسنة) بتركيز ~ 2 مغ/مل مع 0.6 مل كل حل من الحلول 1 مول/لتر من كاكل₂ و Na₂CO₃ تحت التحريك السريع.
   ملاحظة: إيلاء اهتمام لحساسيات مختلفة من الأصباغ الفلورية إلى فوتوبليتشينج؛ إذا كان يتم استخدام مجس فلورسنت حساسة للضوء (مثل سنارف-1)، فلابد من التلاعب وتخزين المجهرية الدقيقة مع كالقليل من الضوء قدر الإمكان.
2. بعد 5-10 ق من الانفعالات، نقل التعليق 2 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق في 10,000-12,000 ز بيليه ميكروكوريس₃ كربونات الكالسيوم.
3. تجاهل المادة طافية ويغسل النوى مع ~ 2 مل مياه ريسوسبيند بيليه بالهز.
4. كرر الإجراء الطرد المركزي والغسل ثلاث مرات في المجموع. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
5. احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
   تنبيه: لا تنسى لحماية الأذنين مع سماعات الرأس.
6. أن تودع في الطبقة الأولى البوليمر على القوالب ريسوسبيند النوى في مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من poly(allylamine hydrochloride) (PAH) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم.
   1. الحفاظ ميكروكوريس في الحل لدقيقة ~ 5 مع الرج المستمر.
   2. وبعد 15 ثانية للطرد المركزي، تجاهل المادة طافية مع الهيئة العامة للإسكان غير منضم. أغسل ميكروكوريس مغطاة بالمياه على الأقل 3 مرات عن طريق الطرد المركزي متعددة والغسيل الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
   3. احتضان ميكروكوريس لمدة 1 دقيقة في حمام الموجات فوق الصوتية للحد على التجميع.
      ملاحظة: إذا كانت صبغة الفلورسنت التطبيقية الأيوني، بدء من بولي (الصوديوم 4-ستيرينيسولفوناتي) (PSS) في 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم (راجع الخطوة 1، 7).
7. كرر الخطوة 1.6 مع مل ~ 2 حل 4 مغ/مل من PSS (كما تحتوي على 1 مول/لتر كلوريد الصوديوم) بإيداع الطبقة الثانية البوليمرية في القوالب.
8. كرر الخطوات من 1.6 و 1.7 ست مرات بإيداع 12 طبقات البوليمر.
   ملاحظة: لا ينصح لتأخذ استراحة طويلة (ح ~ 12 أو أكثر) قد تم إيداع في الإجراء حتى ~ 3-5 طبقات لكربونات الكالسيوم₃ ميكروكوريس دون تغطية قد تميل إلى ريكريستاليزي. ملاحظة أن التغطية PSS الأسباب تجميعاً أعلى من ميكروكوريس، ووقفه طويلة من المستحسن إلا عند الهيئة العامة للإسكان أو بولي-L-يسين المطعمة بالبولي إيثيلين غليكول (PLL-ز-شماعة) هي طبقة قصوى.
9. احتضان ميكروكوريس المغطاة في 2 مغ/مل PLL-ز-شماعة (~ 1 مل كل microtube) على الأقل ح 2.
   1. أغسل ميكروكوريس بالمياه عن طريق الطرد المركزي متسلسلة واستثارة الخطوات. بعد الطرد المركزي الماضي، تجاهل المادة طافية.
10. للحصول على كبسولات رقيقة جداً جوفاء، حل القوالب₃ كربونات الكالسيوم بإضافة 2 مل من 0.1 mol/L الإيثيلين حمض (يدتا) الحل (المعدل للأس الهيدروجيني 7.1 مع هيدروكسيد الصوديوم) إلى ميكروكوريس مغطاة.
    1. بعد دقيقة ~ 5 من الحضانة، الطرد المركزي كبسولات رقيقة جداً 45 ثانية وتجاهل المادة طافية مع يدتا.
    2. كرر الخطوات من 1، 10-1.10.1 مرتين.
11. أغسل كبسولات رقيقة جداً مع 0.9% كلوريد الصوديوم ثلاث مرات عن طريق الطرد المركزي عدة خطوات داخل 45 s متبوعاً بالغسيل الخطوات. بعد آخر خطوة الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: الحل النهائي ميكروكابسولي للحقن يجب أن تظل عقيمة (على سبيل المثال عن طريق إضافة الأمبيسلّين، 0.1 مغ/مل)، ووسائل الإعلام يجب أن يكون متوافق حيويا هدف التحقيق (وسائل الإعلام متساوي التوتر مع الأس الهيدروجيني المحايدة).
12. تقدير تركيز استعداد كبسولات رقيقة جداً في هيموسيتوميتير تحت مجهر الأسفار. اتخاذ سلسلة من الصور من كبسولات رقيقة جداً وقياس القطر حول استخدام البرمجيات⁹ أو ما يعادلها ImageJ كبسولات رقيقة جداً مائة التحقيق في توزيع حجم استخدام الرسم بياني.
13. متجر الحصول على تغليف المسبار في الظلام.
    ملاحظة: بعد عدة الغسالات في العقيمة 0.9% كلوريد الصوديوم، يمكن تخزينها في كبسولات رقيقة جداً لمدة أشهر في 4 درجات مئوية. لا ينصح بتجفيف كاملة من كبسولات رقيقة جداً أثناء التخزين.

2-إعداد الإعداد الضوئية ومعايرة المغلف سنارف-1

ملاحظة: قياسات pH الخام مع المغلف سنارف-1 يمكن إجراء باستخدام الصور في قناتين ل مجهر فلوري⁷، ولكن في هذا البروتوكول مجهر فلوري قناة واحدة متصلة مطياف ألياف طبق.

1. ضع المجموعة المطلوبة من مرشحات الأسفار إلى مجهر فلوري وفقا لخصائص صبغة الفلورسنت التطبيقية وتشغيل المصابيح الفلورية.
   1. سحب الرافعة للعدسات.
      تنبيه: الخفيفة الزائدة يمكن أن تلحق الضرر مصفوفة مطياف. وهكذا، تأكد من أن الذراع في وضع "عينية" عندما لا يستخدم في المطياف.
   2. الاتصال واحدة من نهاية الألياف الضوئية والمطياف والطرف الآخر لصيد تلسكوب. استخدام محولات، مكان صيد تلسكوب في تركيز أنبوب الكاميرا أو منفذ آخر متاح من مجهر فلوري.
   3. قم بتشغيل والمطياف. قم بتشغيل برنامج مراقبة مطياف وإعداد والمطياف للقياسات.
2. لمعايرة دفعة ميكروكابسولي، ضع ~ 5 ميليلتر من تعليق ميكروكابسولي (000 ~ 10 كبسولات رقيقة جداً كل ميليلتر في المياه) على شريحة مجهر، والجاف للهبوط في مكان مظلم (على سبيل المثال، في الحرارة على 35 درجة مئوية).
   1. لمعايرة خصائصها الطيفية المغلف سنارف-1، استخدم سلسلة من المخازن المؤقتة مع قيم الأس الهيدروجيني مختلفة في النطاق ~ 6-9. إسقاط ~ 10 ميليلتر من المخزن المؤقت إلى المجفف كبسولات رقيقة جداً مع سنارف-1-ديكستران وتغطية ذلك مع ساترة.
   2. ضع الشريحة الزجاجية في مرحلة المجهر. قم بتحديد موقع كبسولات رقيقة جداً استخدام هدفا 40 ×.
   3. تشغيل ذراع المجهر إلى منفذ الكاميرا. تسجيل هذه الأسفار مع والمطياف. قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسات.
      ملاحظة: تأكد من إشارة الطيفي أبعد من مستوى الخلفية، والتأكد من أن كبسولات رقيقة جداً في مجال الرؤية ليست في فقاعة (عن طريق التحول إلى تكبير السفلي إذا لزم الأمر). تجنب الإضاءة فترات طويلة من كبسولات رقيقة جداً نفس. سنارف-1 حساس فوتوبليتشينج.
   4. كرر الخطوة 2.2.3 كبسولات رقيقة جداً مختلفة من 10-15 مرة.
3. حساب نسب ذروة الأسفار (على سبيل المثال، استخدام R أو Scilab) لجميع أطياف المسجلة وتحديد خط الانحدار بين المعدل الوسيط (لكل المخزن المؤقت) ومتوسط الرقم الهيدروجيني باستخدام الصيغة التالية:
   
   ملاحظة: قد سنارف-1 طائفة مع قمم اثنين المقابلة لانبعاث صبغ البروتونية وديبروتوناتيد، والنسبة بين القمم تستجيب للرقم الهيدروجيني للوسط. في هذه الدراسة، يتم استخدام النسبة بين كثافة الأسفار ل 605 و 660 شمال البحر الأبيض المتوسط. ويتم اختيار هذه الأطوال الموجية اعتماداً على مجموعة عوامل التصفية المستخدمة. و ب معاملات يحددها الانحدار غير الخطي (على سبيل المثال، باستخدام البحث والتطوير). القيم 0.15 و 1.1 هي، على التوالي، قيم الحد الأدنى والحد الأقصى أنا₆₀₅/I₆₆₀ ولاحظ أثناء المعايرة.
4. جمع حوالي 10 ميليلتر من الدم الأسماك من الحيوانات الكبار حوالي 5. مكان السمك في طبق بتري مع 1 ميليلتر/مل المياه تعليق زيت القرنفل للتخدير والانتظار حتى يتحول على جانبها الحيوان وتوقف عن الاستجابة القرصات زعنفة (عادة ~ 2-3 دقيقة). نقل الأسماك على شريحة زجاج. قطع ذيل سمكة مع مجلة لانسيت، وجمع حوالي 2 ميليلتر من الدم الأسماك من هذا السياق الذيل.
   ملاحظة: لمنع تخثر الدم، علاج الشق مع الهيبارين (5000 U/mL) واستخدام الزجاج هيبارينيزيد الشعيرات الدموية وأنابيب ميكروسينتريفوجي لجمع الدم.
   1. التنقيط حوالي 10 ميليلتر من الدم مع ماصة على غيض من ميكروليكترودي وتحديد الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
   2. قطره دم إلى شريحة مع المجفف كبسولات رقيقة جداً، وسجل نسبة كثافة الأسفار كما هو موضح للمخازن المؤقتة المعايرة (الخطوات 2، 2، 2-3).
5. ضبط المعامل الخطي على منحنى المعايرة لجعل المنحنى يتطابق مع القياسات في دم الأسماك (لمزيد من التفاصيل انظر بورفينسكايا وآخرون عام 2017⁵).

3-التحضير للحقن

1. الإفراج عن إبرة الصلب من طرف القلم الأنسولين (أو حقنه) عن طريق إزالة البلاستيك مع انسيت حادة.
   ملاحظة: أي إبرة رقيقة (Ø0.33 ملم أو أقل) أو الزجاج الشعرية (عادة Ø1 مم) يمكن أن تكون مستعدة ل microinjection^10،11.
2. أدخل الإبرة في منتصف الطريق في ميكروكابيلاري الزجاج؛ بسرعة ولطف جندي باستخدام شعلة غاز.
3. الاتصال ميكروكابيلاري الزجاج ميكروينجيكتور ومسح بالماء المعقم ثلاث مرات. ضمان تدفق السائل من خلال الإبرة.
4. ملء هذا النظام مع الماء المقطر.
   ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات في النظام.

4-حقن

1. ريسوسبيند تعليق استعداد كبسولات رقيقة جداً (من العقيمة 0.9% استخدام كلوريد الصوديوم، أو أية وسائط أخرى للحقن، مع تركيز من 0.5 إلى 6 مليون كبسولات رقيقة جداً الواحد ميكروليتير) استخدام الحمام بالموجات فوق الصوتية لمدة 1 دقيقة.
   ملاحظة: منذ كبسولات رقيقة جداً تميل إلى أن يعجل، من خلال حقن التالية، تهز القنينة مع كبسولات رقيقة جداً ميكانيكيا (باستخدام دوار) أو يدوياً كل بضع دقائق ريسوسبيند لهم ومنع على التجميع.
2. ضع السمك في طبق بتري مع مخدر (0.1 مل/لتر زيت القرنفل معلقة في الماء) ~ 2-3 دقيقة انتظر حتى الأسماك يتحول على جانبها وتوقف عن الاستجابة إلى رشة خفيفة fin.
3. باستخدام ملعقة، نقل الأسماك من المخدر ووضعه برفق على اسفنجة رطبة في موقف أفقي مع الرأس نحو اليسار (للشخص اليد اليمنى) أو نحو اليمين (بالنسبة لشخص أعسر).
4. قبل الحقن، تمتص 1-2 مم هواء إلى الزجاج الشعرية المرتبطة ميكروينجيكتور. ثم تحميله مع حوالي 2 ميليلتر من كبسولات رقيقة جداً فرقت.
   ملاحظة: قبل الحقن، يجب تعديل الحل ميكروكابسولي إلى درجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ الأسماك.
5. بلطف استقرار جسم الأسماك في الأسفنج مع جهة غير المهيمنة.
   1. البحث عن الخط الجانبي للأسماك. حدد جزء الذي يمتد من operculum إلى نهاية تجويف البطن عقلياً. العثور على الوسط من هذا الجزء. وضع الإبرة 1 ملم أقل في اتجاه البطني.
   2. مع حركة القشط، تحرك بلطف السمك جداول جانبا، وجعل ثقب. أدخل الإبرة في الجسم بزاوية 45 ° إلى السطح الجدول.
   3. دفع الإبرة نحو العمود الفقري ثم ضعه بعناية ضدها.
   4. الإفراج عن حوالي 1 ميليلتر من تعليق كبسولات رقيقة جداً في الكلي، وسحب الإبرة ببطء.
      ملاحظة: للعثور على الموقع الصحيح ثقب بسهولة أكبر، أنها مفيدة للممارسة إيجاد الكلي الجذع ترانسيلوميناتينج الأسماك باستخدام ضوء السفلي، كما هو مبين في الشكل 2 ألف و 2 باء.
6. يشطف السمك من الرأس إلى الذيل مع تيار الماء لإزالة أي كبسولات رقيقة جداً المنسكب في موقع الحقن.

5. التصور في فيفو

1. استخدام مقص تشريح لإزالة غطاء الخياشيم من رأس السمك وأنصارها الخياشيم السمكية. شطف الخياشيم مع الماء.
2. باستخدام ملعقة، نقل الأسماك إلى شريحة مجهر، ووضعه في مرحلة مجهر فلوري.
   ملاحظة: تأكد من أن خياشيم الأسماك لم تجف خلال الإجراءات المتعاقبة. لتجنب هذا الأمر، بشكل دوري ترطيب لهم مع المياه باستخدام ماصة باستور (تقريبا كل دقيقة 1-2).
3. تلقي بظلالها الغرفة واستخدام التكبير المنخفض (× الهدف 10) تفقد الخياشيم للعثور كبسولات رقيقة جداً الفلورسنت.
   ملاحظة: عند استخدام هذا الإجراء لإدخال بعض الجسيمات الفلورية في الأسماك الدموية، من المستحسن لتفقد الخياشيم للعديد من الأفراد للجسيمات الفلورية غير متوقعة قبل الحقن. لا تملك خياشيم الزرد البرية من نوع أوتوفلوريسسينسي، ولكن في بعض الحالات المتفرقة الجسيمات الفلورية (مثل قطع الطعام أو أحادي الخلية سيمبيونتس) قد تكون موجودة على الخياشيم. إذا الضرورية، مثل هذه الجسيمات يمكن التعرف عليها استناداً على شكل معين (على سبيل المثال، قد قطع الغذاء شكل منتظم، على عكس كروية كبسولات رقيقة جداً) أو الطيف الأسفار (أي لون).
   1. تبديل العدسة إلى قوته أعلى (الهدف × 40)، وموقف ميكروكابسولي أو مجموعة من كبسولات رقيقة جداً في مركز مجال الرؤية.
   2. تشغيل الذراع إلى الميناء مع مطياف متصلة. تسجيل إشارة الطيفية.
   3. قم بتشغيل الرافعة مرة أخرى إلى العدسة.
   4. كرر القياسات مختلفة كبسولات رقيقة جداً عدة مرات.
4. نقل الأسماك إلى حوض السمك مع التهوية المناسبة للانتعاش.
   ملاحظة: مع الحد الأدنى من الممارسة، من الممكن القيام بالحقن وإشارة تسجيل معدل تقريبي من 2-3 دقيقة لكل الأسماك. يمكن تكرار القياس واحد فردية عدة مرات باستخدام جرعات منخفضة، غير مؤذية المتكررة للتخدير أو أسلوب آخر للتثبيت. للمراقبة طويلة الأجل، واستخدام نظام مع التخدير المستمر¹².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تأتي النتائج التي تم الحصول عليها من واحدة من الفئات الرئيسية الثلاث للبروتوكول المقدم: تشكيل المجهرية الدقيقة الفلورسنت بتغليف صبغة الفلورسنت (الشكل 1)، حقن كبسولات رقيقة جداً مع مزيد من المرئيات في الكلي جيل الشعيرات الدموية (الشكل 2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وللتدليل على الحقن المجهرية الدقيقة في الكلي الزرد، استخدمنا شبه نفاذية كبسولات رقيقة جداً محملة صبغ مؤشر. وهكذا، يتضمن البروتوكول إرشادات لتصنيع كبسولات رقيقة جداً استخدام الجمعية طبقة بطبقة polyelectrolytes المشحونة معاكس^7،8،،من¹⁵

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescent probe
Calcium chloride	SIGMA	C1016	CaCO3 templates formation
Sodium carbonate	SIGMA	S7795	CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride	SIGMA	S8776	To dissolve applied polymers
Water Purification System	Millipore	SIMSV0000	To prepare deionized water
Magnetic stirrer	Stegler		For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL	F.L. Medical	28093	Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner			To reduce microcapsule aggregation
Head phones			To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	EDS	To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate	SIGMA	S9638	Preparation of pH buffers
Disodium phosphate	SIGMA	S9390	Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide	SIGMA	S8045	To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber			To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber			To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2	LOMO		In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)	Chroma	79010	Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide	Fisherbrand	12-550-A3	Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	To collect fish blood
Clove oil	SIGMA	C8392	Fish anesthesia
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode	Mettler Toledo		To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	For injection procedure
Gas torch			To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene	SIGMA	P5481	For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon			For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge			For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors	Thermo Scientific	31212	To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL	BRAND	Z331767	To moisten fish gills