Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек

Резюме

Эта статья демонстрирует принципы быстро, миниинвазивная инъекции флуоресцентные микрочастиц в circulatory system рыбки и визуализации в vivo микрочастиц в крови рыб.

Аннотация

Системного администрирования микро размера частиц в живой организм может применяться для визуализации сосудистую, наркотиков и вакцинации, имплантации крошечные оптических датчиков и трансгенных клеток. Однако внутривенного введения микроинъекций в мелких животных, которые в основном используются в биологических и ветеринарных лабораторий, очень сложны и требуют квалифицированного персонала. Здесь мы демонстрируем надежный и эффективный метод для введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио (Danio рерио) путем инъекций в рыбы почек. Чтобы визуализировать введено микрочастиц в сосудистую, мы предлагаем простой метод прижизненной визуализации в жабры рыбы. В естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио была выполнена с использованием вводят Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1, чтобы продемонстрировать один из возможных применений описанные методики. Эта статья содержит подробное описание инкапсуляции рН чувствительных красителя и демонстрирует принципы быстрой инъекции и визуализации полученных микрокапсулы для записи в vivo флуоресцентного сигнала. Предложенный метод впрыска характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования. Все описанные процедуры можно выполнять на других мелких рыб, таких как гуппи и оризии.

Введение

Администрация микро размера частиц в организм животных является одной из важных задач в таких областях, как наркотиков и доставки вакцины¹, сосудистую визуализации², трансгенными ячейку имплантации³и имплантации крошечные оптический датчик ^{4 , 5}. Однако, трудно процедура имплантации микромасштабной частиц в сосудистой системе мелких лабораторных животных, особенно для деликатной водных организмов. Для популярных исследований образцов как данио рерио, он сообщил, что эти процедуры необходимо уточнить с помощью видео протоколов.

Внутрисердечной и капиллярной микроинъекций требуют квалифицированного персонала и уникальных микрохирургии зал для доставки microobjects в zebrafish кровь. Ранее ретро орбиталь ручной инъекций³ было предложено как простой и эффективный метод для управления всей клетки. Однако по нашему опыту, из-за небольшой площади глаз капиллярной сети, это занимает много практики для достижения желаемых результатов от этого метода.

Здесь мы описываем метод для надежной и эффективной микрочастица имплантации в кровеносную систему путем ручной инъекции непосредственно в ткани почек взрослых рыбок данио, который богат капилляров и почечных сосудов. Эта техника основана на протоколе видео для трансплантации клеток в zebrafish почек⁶, но болезненным и длительным микрохирургическое шаги были ликвидированы. Предложенный метод характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования.

Важной частью предлагаемого протокола является визуализация имплантированных микрочастиц (если они флуоресцентные или раскрашенная) в капиллярах Гилл, который позволяет для проверки качества инъекции, грубый относительной оценки числа вводят частицы и обнаружение спектрального сигнала для физиологических измерений непосредственно из циркулирующей крови. В качестве примера возможных применений описаны методики, мы демонстрируем протокол для измерений в vivo данио рерио рН крови с помощью Микрокапсулированный флуоресцентного зонда, SNARF-1, первоначально предложенных в Borvinskaya и др. 2017⁵.

протокол

Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с директивой ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных и были одобрены животное темам исследований Комитета из Института биологии Иркутского государственного университета.

1. Изготовление микрокапсулы

Примечание: Микрокапсулы, ношение флуоресцентные краски готовятся с использованием слой за слоем Ассамблеи противоположно заряженных полиэлектролитов^7,8. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре.

1. Для синтеза пористых СаСО₃ microcores, включающего Люминесцентную краску, смешайте 2 мл раствора SNARF-1-декстрана (большинство полимер прыгните Люминесцентную краску например FITC-BSA могут использоваться) в концентрации ~ 2 мг/мл с 0,6 мл каждого из решений CaCl_{2 1 моль/Л} и Na₂CO₃ под быстро помешивая.
   Примечание: Обратить внимание на различные чувства флуоресцентных красителей в Фотообесцвечивание; Если используется светочувствительные флуоресцентного зонда (как SNARF-1), манипулирования и хранения микрочастиц должны выполняться с как мало света как можно скорее.
2. После 5-10 s агитации, передать подвеска 2 мл microcentrifuge трубы и центрифуги для 15 s на 10000-12000 g для пеллет СаСО₃ microcores.
3. Отменить супернатанта, мыть ядер с ~ 2 мл деионизированной воды и Ресуспензируйте гранулы путем встряхивания.
4. Повторите процедуру центрифугирования промывание три раза в общей сложности. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
5. Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
   Предупреждение: Не забудьте защитить уши с наушниками.
6. Внести первый полимерный слой на шаблоны, Ресуспензируйте ядер в ~ 2 мл 4 мг/мл раствора poly(allylamine hydrochloride) (ПАУ) в 1 моль/Л NaCl.
   1. Держите microcores в растворе для ~ 5 мин при постоянном встряхивании.
   2. После 15 s центрифугирования, удалить супернатант с несвязанных ПАУ. Вымойте покрыты microcores с дейонизированной водой по крайней мере 3 раза через несколько центрифугирования и мытье шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
   3. Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
      Примечание: Если прикладной флуоресцентного красителя катионного, начните с поли (натрия 4-styrenesulfonate) (PSS) в 1 моль/Л NaCl (см. шаг 1.7).
7. Повторите шаг 1.6 с ~ 2 мл 4 мг/мл раствора PSS (также содержащие 1 моль/Л NaCl) для депозита второй полимерный слой на шаблоны.
8. Повторите шаги 1.6 и 1.7 шесть раз депозита 12 полимерные слои.
   Примечание: Не рекомендуется сделать длинный перерыв (~ 12 ч или больше) в процедуре до ~ 3-5 слоев сдали потому что СаСО₃ microcores без покрытия могут, как правило, recrystallize. Обратите внимание, что PSS покрытие вызывает выше агрегации microcores, и долгой паузы рекомендуется только тогда, когда ПАУ или поли L-лизин привитый с полиэтиленгликоля (PLL-g-PEG) является исключительно слой.
9. Проинкубируйте покрыты microcores в 2 мг/мл PLL-g ПЭГ (~ 1 мл микропробирок) для по крайней мере 2 ч.
   1. Мыть microcores с водой через последовательные центрифугирования и ресуспендирования шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
10. Чтобы получить полые микрокапсулы, Растворите СаСО₃ шаблоны, добавив 2 мл раствора 0,1 моль/Л Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (с учетом рН 7,1 с NaOH) покрыты microcores.
    1. После ~ 5 минут инкубации, центрифуга микрокапсулы для 45 s и удалить супернатант с ЭДТА.
    2. Повторите шаги 1.10-1.10.1 дважды.
11. Вымойте микрокапсулы с 0,9% NaCl три раза через несколько центрифугирования шаги в пределах 45 s следуют мытья шаги. После последнего шага центрифугирования удалить супернатант.
    Примечание: Окончательный микрокапсульная раствор для инъекций должны храниться стерильные (например, путем добавления ампициллин, 0,1 мг/мл), и средства массовой информации должны быть биологически совместимого с целью расследования (изотонические СМИ с нейтральным pH).
12. Оценки концентрации подготовленных микрокапсулы в Горяева под флуоресцентным микроскопом. Сделать серию фотографий микрокапсулы, измерить диаметр о ста микрокапсулы, используя ImageJ⁹ или эквивалент программного обеспечения и исследовать распределение по размерам, с помощью гистограммы.
13. Хранилища, полученные инкапсулированные зонд в темноте.
    Примечание: после нескольких стирок в стерильного 0,9% NaCl, микрокапсулы могут храниться месяцами при 4 ° C. Полного высыхания микрокапсулы во время хранения не рекомендуется.

2. Подготовка оптические установки и калибровки Микрокапсулированный SNARF-1

Примечание: Грубая рН измерения с микрокапсулами SNARF-1 могут быть сделаны с использованием изображений в двух каналах флуоресцентный Микроскоп⁷, но в настоящем Протоколе, один одноканальной флуоресцентный Микроскоп связаны волоконно-спектрометр был применен.

1. Установите необходимый набор фильтров флуоресценции флуоресцентный Микроскоп согласно характеристикам применяемых Люминесцентную краску и включите люминесцентных ламп.
   1. Вытяните рычаг окуляры.
      Предупреждение: Избыток света может повредить спектрометр матрицы. Таким образом убедитесь, что рычаг находится в режиме «окуляр», когда не используется спектрометр.
   2. Подключите один конец волоконно-оптических спектрометр и другой конец к коллиматора. С помощью адаптеров, место коллиматор в фокус камеры трубки или другой доступный порт флуоресцентный Микроскоп.
   3. Включите спектрометр. Запустите программу управления спектрометр и подготовить спектрометр для измерений.
2. Для калибровки микрокапсульная партии место ~ 5 мкл микрокапсульная подвески (~ 10 000 микрокапсулы за мкл в деионизированной воде) на слайде микроскопа и сухой капли в темном месте (например, в термостат при температуре 35 ° C).
   1. Для калибровки спектральные характеристики Микрокапсулированный SNARF-1, используйте серию буферов с различными pH в диапазоне ~ 6-9. Падение ~ 10 мкл буфера на сушеные микрокапсулы с SNARF-1-декстран и покрывают его с coverslip.
   2. Место стеклянное скольжение на микроскопа. Найдите микрокапсулы, используя × 40 цель.
   3. Поверните рычаг Микроскоп к порту камеры. Зарегистрируйте их флуоресценции с помощью спектрометра. Поверните рычаг обратно в окуляры.
      Примечание: Убедитесь, что спектральная сигнал выходит далеко за рамки фонового уровня и убедитесь что микрокапсулы в поле зрения не в пузырь (путем переключения на нижней увеличение при необходимости). Избегайте длительного освещения же микрокапсулы. SNARF-1 чувствителен к Фотообесцвечивание.
   4. Повторите шаг 2.2.3 для различных микрокапсулы 10 - 15 раз.
3. Рассчитать коэффициенты пика флуоресценции (например, с помощью R или Scilab) для всех зарегистрированных спектров и определить линии регрессии между средний коэффициент (для каждого буфера) и Средний рН, по следующей формуле:
   
   Примечание: SNARF-1 имеет спектр с двумя пиками, соответствующих выбросов протонированных и депротонированная красителя, и соотношение между пиками реагировать рН среды. В этом исследовании используется соотношение между интенсивностью флуоресценции для 605 и 660 нм. Эти длины волн выбираются в зависимости от используемых набор фильтров. и b являются коэффициенты определяются нелинейной регрессии (например, с помощью R). Значения, 0,15 и 1.1 являются, соответственно, минимальное и максимальное значения я605/iий₆₆₀ наблюдается во время калибровки.
4. Соберите около 10 мкл крови рыб от приблизительно 5 взрослых животных. Место рыбы в чашке Петри с 1 мкл/мл воды подвеска гвоздичное масло для анестезии и подождать до тех пор, пока животное оказывается на его стороне и перестает отвечать на щепотки плавника (обычно ~ 2-3 мин). Передача рыбы на стеклянное скольжение. Отрезать хвост рыбы с стрельчатые и собирать примерно 2 мкл крови рыб из Вены хвост.
   Примечание: Для предотвращения свертывания крови, лечить разрез с гепарином (5000 ед/мл) и использовать гепаринизированным стеклянные капилляры и microcentrifuge трубки для сбора крови.
   1. Капельного около 10 мкл крови с пипеткой на кончик микроэлектродные и определить с помощью рН метр pH.
   2. Капля крови на слайд с микрокапсулами сушеные и зарегистрировать отношение интенсивности флуоресценции, как описано для калибровки буферов (шаги 2.2-2.3).
5. Отрегулируйте коэффициент линейной калибровочной кривой сделать кривой соответствуют измерениям в крови рыбы (для более подробную информацию см. Borvinskaya et al. 2017⁵).

3. подготовка для инъекций

1. Выпуск стальной иглой от кончика инсулина пера (или шприц), удалив пластиковые с острым Ланцет.
   Примечание: Любой тонкой иглой (Ø0.33 мм или меньше) или стеклянные капиллярные (обычно Ø1 мм) могут быть подготовлены для микроинъекции^10,11.
2. Вставьте иглу на полпути в микрокапиллярной стекла; быстро и аккуратно спаять его с помощью газовой горелки.
3. Подключите микрокапиллярной стекла к microinjector и промыть стерильной водой три раза. Убедитесь, что жидкость течет через иглу.
4. Заполните систему с дистиллированной водой.
   Примечание: Убедитесь, что в системе существует никаких пузырей.

4. инъекции

1. Ресуспензируйте подготовленный подвеска микрокапсулы (стерильного 0,9% NaCl, или любые другие средства массовой информации используются для инъекций, с концентрацией 0,5 до 6 миллионов микрокапсулы в микролитр) с помощью Ультразвуковая ванна на 1 мин.
   Примечание: Поскольку микрокапсулы, как правило, осадок, во время следующей инъекции, встряхните флакон с микрокапсулами механически (с помощью ротора) или вручную каждые несколько минут, чтобы Ресуспензируйте их и предотвращать их агрегирования.
2. Место рыбы в чашке Петри с анестетиком (0,1 мл/Л масла гвоздики, взвешенных в воде) ~ 2-3 минут ждать пока рыба превращается на его стороне и перестает отвечать на легкий Пинч плавника.
3. С помощью ложки, передача рыбы из анестетиков и осторожно поместите его на влажной губкой в боковой позиции с головой влево (для правша) или вправо (для левшей человека).
4. Как раз перед инъекцией сосать 1-2 мм воздуха в стеклянный капилляр связаны с microinjector. Затем загрузите его с приблизительно 2 мкл дисперсной микрокапсулы.
   Примечание: Перед инъекцией, микрокапсульная решения должны быть скорректированы до температуры, на котором хранятся рыбы.
5. Аккуратно стабилизируйте тело рыбы на губку с недоминирующей руки.
   1. Найти боковой линии рыб. Мысленно выделите сегмент, который простирается от крышечки до конца брюшной полости. Найти в середине этого сегмента. Положите иглы 1 мм ниже в вентральной направлении.
   2. Соскоб движением аккуратно переместите Рыба весы в сторону и сделать прокол. Вставьте иглу в тело под углом 45° к поверхности стола.
   3. Вставьте иглу к позвоночника до тех пор, пока он тщательно лежит против него.
   4. Выпуск примерно 1 мкл суспензии микрокапсулы в почках и медленно снять иглу.
      Примечание: Чтобы найти надлежащее прокол сайт более легко, полезно практике найти ствол почек, к рыб, используя свет снизу, как показано на рис. 2A и 2B.
6. Промывайте рыбу от головы до хвоста с потоком воды, чтобы удалить любые пролитой микрокапсулы в месте инъекции.

5. Визуализация в естественных условиях

1. Используйте ножницы рассечение, чтобы удалить жаберной крышки из головы рыбы и оголять жабры рыбы. Промывайте жабры с водой.
2. С помощью ложки, передача рыбы для микроскопа и поместите его на сцене флуоресцентный Микроскоп.
   Примечание: Убедитесь, что жабры рыбы не высохнуть в течение последовательных процедур. Чтобы избежать этого, периодически смачивают их водой с помощью пипетки Пастера (примерно каждые 1-2 мин).
3. Затемнить номер и используя низкий масштаб (x 10 цель) осмотрите жабры найти флуоресцентные микрокапсулы.
   Примечание: При процедуре используется для внедрения некоторых флуоресцентные частицы в рыбы сердечно-сосудистой системы, рекомендуется проверять жабры нескольких лиц для неожиданных флуоресцентные частицы до инъекции. Жабры данио рерио одичал типа не имеют аутофлюоресценция, но в некоторых случаях отдельные флуоресцентные частицы (как куски пищи или одноклеточные симбионтами) могут присутствовать на жабры. При необходимости, такие частицы могут быть признаны на основании их определенной формы (например, куски пищи имеют неправильную форму, в отличие от сферического микрокапсулы) или спектр флуоресценции (то есть, цвет).
   1. Переключитесь выше величины (цель × 40) объектив и положение микрокапсульная или группы микрокапсулы в центре поля зрения.
   2. Поверните рычаг в порт с подключенного спектрометр. Запись спектрального сигнала.
   3. Поверните рычаг обратно в окуляр.
   4. Повторите измерения для различных микрокапсулы несколько раз.
4. Трансфер рыбы в аквариуме с надлежащей аэрации для восстановления.
   Примечание: С минимальной практике, это возможно для выполнения инъекций и сигнал записи с приблизительной скоростью 2-3 мин на рыбу. Измерение может быть повторен для отдельных несколько раз с использованием повторных доз низкой, безвредные анестезии или другой метод фиксации. Для долгосрочного наблюдения используйте систему с непрерывной анестезии¹².

Результаты

Полученные результаты приходят от одного из трех основных категорий представленных протокола: формирование флуоресцентный микрочастиц путем инкапсуляции флуоресцентные краски (рис. 1), почки инъекции микрокапсулы с дальнейшей визуализации в Джилл к?...

Обсуждение

Чтобы продемонстрировать инъекции микрочастиц в почках данио рерио, мы использовали полупроницаемой микрокапсулы, загружен с красителем индикатора. Таким образом в протоколе содержатся инструкции для изготовления микрокапсулы, используя слой за слоем Ассамблея противоположно заря?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescent probe
Calcium chloride	SIGMA	C1016	CaCO3 templates formation
Sodium carbonate	SIGMA	S7795	CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride	SIGMA	S8776	To dissolve applied polymers
Water Purification System	Millipore	SIMSV0000	To prepare deionized water
Magnetic stirrer	Stegler		For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL	F.L. Medical	28093	Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner			To reduce microcapsule aggregation
Head phones			To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	EDS	To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate	SIGMA	S9638	Preparation of pH buffers
Disodium phosphate	SIGMA	S9390	Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide	SIGMA	S8045	To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber			To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber			To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2	LOMO		In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)	Chroma	79010	Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide	Fisherbrand	12-550-A3	Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	To collect fish blood
Clove oil	SIGMA	C8392	Fish anesthesia
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode	Mettler Toledo		To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	For injection procedure
Gas torch			To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene	SIGMA	P5481	For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon			For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge			For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors	Thermo Scientific	31212	To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL	BRAND	Z331767	To moisten fish gills