ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

Summary

מאמר זה מדגים את העקרונות של זריקה מהירה, פולשנית של פלורסנט microparticles את circulatory system של דגים קטנים, הפריט החזותי ויוו של microparticles בדם דגים.

Abstract

המינהל מערכתית של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם יכול להיות מיושם להערכת ויזואליזציה, סמים, משלוח חיסון, ההשתלה של תאים הטרנסגניים וחיישנים אופטי זעיר. עם זאת, microinjections תוך ורידי לתוך חיות קטנות, אשר משמשים בעיקר במעבדות ביולוגי, וטרינרית, קשה מאוד, דורשת צוות מיומן. במסמך זה, נדגים שיטה חזקה ויעילה המבוא של microparticles לתוך מערכת הדם של דג זברה למבוגרים (רזבורה rerio) על ידי זריקה לתוך הכליה דגים. כדי להמחיש את microparticles הציג ב להערכת, אנו מציעים טכניקה פשוטה הדמיה intravital ב זימים של דג. In vivo ניטור pH הדם דג זברה הושג באמצעות פלורסנט microencapsulated מוזרק בדיקה, SNARF-1, כדי להדגים את אחד היישומים האפשריים של הטכניקה המתוארת. מאמר זה מספק תיאור מפורט העטיפה של pH רגיש צבע ומדגים את עקרונות הזריקה מהירה והדמיה של מהמיקרו קפסולות שהושג ויוו הקלטה של האות פלורסנט. השיטה המוצעת של הזרקת מאופיין על ידי שיעור התמותה נמוכה (0-20%) ואת יעילות גבוהה (70-90% הצלחה), וזה קל של מכון התקנים באמצעות ציוד זמין נפוץ. ניתן לבצע בכל ההליכים המתוארים במינים אחרים של דגים קטנים, כגון דגים ו- medaka.

Introduction

המינהל של חלקיקים בגודל מיקרו לתוך אורגניזם בעל חיים הינה משימה חשובה בתחומים כמו סמים, חיסון משלוח¹, להערכת ויזואליזציה², תא הטרנסגניים השרשה³וחיישן אופטי זעיר השרשה ^{4 , 5}. עם זאת, הליך ההשתלה microscale חלקיקים לתוך מערכת כלי הדם של חיות מעבדה קטנה קשה, במיוחד עבור אורגניזמים ימיים עדין. עבור דגימות מחקר פופולרי כמו דג זברה, מומלץ כי הליכים אלה מובהר, שימוש בפרוטוקולי הוידאו.

Microinjections intracardiac, נימי דורשים צוות מיומן ומתקני למיקרו ייחודי למסירה של microobjects לדם דג זברה. בעבר, הזרקת ידנית רטרו-מסלולית³ הוצע כמו שיטת קלה ויעילה לניהול התוכן של תאים שלמים. עם זאת, מניסיוננו, בגלל שטח קטן של הרשת נימי העין, זה לוקח הרבה ניסיון כדי להשיג את התוצאה הרצויה של טכניקה זו.

במסמך זה, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה microparticle השרשה לתוך מערכת הדם על ידי זריקה ידנית ישירות לתוך רקמת הכליה של דג זברה בוגרת, אשר הוא עשיר נימים וכלי כליות. טכניקה זו מבוססת על פרוטוקול וידאו עבור השתלת תא לתוך הכליה דג זברה⁶, אך השלבים המיקרוכירורגית טראומטי ולגזול חוסלו. השיטה המוצעת מאופיין התמותה נמוכה (0-20%) ואת יעילות גבוהה (70-90% הצלחה), וזה קל של מכון התקנים באמצעות ציוד זמין נפוץ.

חלק חשוב של הפרוטוקול המוצע הוא החזיית מושתל microparticles (אם הם נמצאים פלורסנט או ולצבוע אותם) הנימים גיל, מה שמאפשר עבור האימות של איכות הזרקה, הערכה יחסית קשה של מספר חלקיקים מוזרק, זיהוי האות ספקטרלי מדידות פיזיולוגיות ישירות מתוך במחזור הדם. כדוגמה היישומים האפשריים של הטכניקה המתוארת, נדגים את פרוטוקול ויוו מדידות של דג זברה החומציות בדם באמצעות בדיקה פלורסנט microencapsulated, SNARF-1, Borvinskaya שהוצע במקור ב et al. 2017⁵.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים ניסיוני נערכו בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי על ניסויים בבעלי חיים, אושרו על ידי החיה נושאים מחקר הוועדה של המכון לביולוגיה באוניברסיטת אירקוטסק.

1. ייצור של מהמיקרו קפסולות

הערה: נושא של הפלורסנט מהמיקרו קפסולות מוכנות תוך שימוש אסיפה שכבה אחרי שכבה של הפוך טעונה polyelectrolytes^7,8. כל ההליכים בוצעו בטמפרטורת החדר.

1. לסנתז נקבובי microcores₃ של קאקו, תוחמת את הפלורסנט, מערבבים 2 מ"ל של הפתרון SNARF-1-לתוספי (רוב פולימר מכורך הפלורסנט כגון FITC-BSA יכול לשמש)-ריכוז של ~ 2 מ"ג/מ"ל עם 0.6 מ"ל כל אחד הפתרונות 1 מול/ליטר של CaCl₂ ו-₂CO נה₃ תחת ערבוב מהיר.
   הערה: שימו לב שהיא התכוונה שונים של צבעי פלורסנט כדי photobleaching; אם בדיקה פלורסנט רגישים לאור (כמו SNARF-1), מניפולציה ואת אחסון של microparticles חייב להתבצע עם כמו אור קטן ככל האפשר.
2. לאחר 5-10 s של עצבנות, להעביר את המתלים צינורות microcentrifuge 2 מ"ל, צנטריפוגה 15 s ב 10,000-12,000 g כדי הצניפה קאקו₃ microcores.
3. למחוק את תגובת שיקוע, לשטוף את הליבות עם ~ 2 מ ל מים יונים, resuspend בגדר ע י ניעור.
4. חזור על הפעולות צנטריפוגה-כביסה שלוש פעמים בסך הכל. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.
5. דגירה של microcores עבור 1 דקות באמבט אולטראסוני כדי להפחית את מצבור שלהם.
   התראה: אל תשכחו להגן על האוזניים עם אוזניות.
6. להפקיד את השכבה הראשונה פולימריים על התבניות, resuspend הליבות ב ~ 2 מ"ל של פתרון 4 מ"ג/מ"ל של poly(allylamine hydrochloride) (הפה) 1 מול/ליטר NaCl.
   1. שמור microcores את הפתרון עבור ~ 5 דקות עם טלטול מתמיד.
   2. לאחר 15 s של צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע עם הפה לא מאוגד. לשטוף את microcores מכוסה עם מים יונים לפחות 3 פעמים באמצעות צנטריפוגה מרובים ושטיפת צעדים. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.
   3. דגירה של microcores עבור 1 דקות באמבט אולטראסוני כדי להפחית את מצבור שלהם.
      הערה: אם יישומי הפלורסנט cationic, להתחיל פוליפוני (נתרן 4-styrenesulfonate) (PSS) 1 מול/ליטר NaCl (ראה שלב 1.7).
7. חזור על שלב 1.6 עם ~ 2 מ"ל של פתרון 4 מ"ג/מ"ל של PSS (גם המכיל mol 1/L NaCl) להפקיד את השכבה השנייה פולימריים על התבניות.
8. חזור על שלבים 6 פעמים 1.6 ל- 1.7 להפקיד 12 שכבות פולימריים.
   הערה: לא מומלץ לקחת הפסקה ארוכה (~ 12 שעות או יותר) במסגרת ההליך עד ~ 3-5 שכבות נצברים קאקו microcores₃ ללא כיסוי עשוי נוטים recrystallize. שים לב PSS כיסוי גורם צבירה גבוה יותר של microcores, הפסקה ארוכה, מומלץ שרק כאשר הפה או פולי-L-ליזין הושתל עם פוליאתילן גליקול (PLL-g-PEG) היא השכבה החיצוני ביותר.
9. דגירה של microcores מקורה ב- 2 מ"ג/מ"ל של PLL-g-יתד (~ 1 מ"ל לכל microtube) כבר לפחות שעתיים.
   1. לשטוף את microcores עם מים בעזרת צנטריפוגה רציפים והשלבים resuspension. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע.
10. כדי להשיג מהמיקרו קפסולות חלול, מתמוסס התבניות₃ קאקו על-ידי הוספת 2 מ של 0.1 מול/ליטר ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון (מותאם pH 7.1 עם NaOH) microcores מקורה.
    1. לאחר ~ 5 דקות של דגירה, centrifuge מהמיקרו קפסולות עבור 45 s ו להשליך תגובת שיקוע עם EDTA.
    2. חזור על שלבים 1.10-1.10.1 פעמיים.
11. לשטוף מהמיקרו קפסולות עם 0.9% NaCl 3 פעמים באמצעות צנטריפוגה מספר צעדים בתוך 45 s ולאחריה שטיפה צעדים. לאחר השלב האחרון צנטריפוגה, למחוק את תגובת שיקוע.
    הערה: הפתרון הסופי microcapsule להזרקה חייב להישמר סטרילי (לדוגמה על-ידי הוספת אמפיצילין, 0.1 מ"ג/מ"ל), התקשורת. לא מסתיימים מושא החקירה (מול מדיה עם חומציות ניטראלית).
12. מעריכים את ריכוז מהמיקרו קפסולות מוכן ב hemocytometer תחת מיקרוסקופ זריחה. בסדרת תמונות של מהמיקרו קפסולות, למדוד את הקוטר על מאה מהמיקרו קפסולות באמצעות תוכנה⁹ או שווה ערך ImageJ, ולחקור את התפלגות גודל באמצעות היסטוגרמה.
13. חנות שהושג אנקפסולציה בדיקה בחושך.
    הערה: לאחר מספר כביסות סטרילי 0.9% NaCl, מהמיקרו קפסולות ניתן לאחסן במשך חודשים-4 מעלות צלזיוס. לא מומלץ ייבוש מוחלט של מהמיקרו קפסולות במהלך האחסון.

2. הכנת ההתקנה אופטי וכיול של SNARF Microencapsulated-1

הערה: מדידות pH קשה עם SNARF microencapsulated-1 יכול להתבצע באמצעות תמונות בשני ערוצים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי⁷, אך ב פרוטוקול זה מיקרוסקופ פלואורסצנטי ערוץ אחד מחובר ספקטרומטר סיבים היה מוחל.

1. מקום קבוצת זריחה מסננים כדי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לפי מאפייני הפלורסנט להחיל הנדרש והפעל את נורה פלואורסצנטית.
   1. למשוך את הידית עיניות.
      התראה: עודף אור יכול להזיק המטריקס ספקטרומטר. לפיכך, ודא כי המנוף הוא במצב "עינית" כאשר ספקטרומטר אינו בשימוש.
   2. חבר קצה אחד של סיבים אופטיים של ספקטרומטר ואת הקצה השני קולימטור. באמצעות מתאמי, מקם את קולימטור המוקד של הצינור מצלמה או אחרים היציאות הזמינות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   3. הפעל את ספקטרומטר. הפעל את תוכנית בקרה ספקטרומטר ולהתכונן ספקטרומטר את המידות.
2. לצורך כיול של אצוות microcapsule, מקום ~ 5 µL של ההשעיה microcapsule (~ 10 000 מהמיקרו קפסולות לכל µL במים יונים) בשקופית מיקרוסקופ, יבש הירידה במקום חשוך (לדוגמה, בתרמוסטט-35 ° C).
   1. כדי לכייל את מאפייני ספקטרלי של microencapsulated SNARF-1, השתמש סדרה של מאגרי בערכי pH שונים בטווח ~ 6-9. זרוק ~ 10 µL של מאגר על גבי מהמיקרו קפסולות מיובשים עם SNARF-1-לתוספי, לכסות את זה עם coverslip.
   2. מקם את השקופית זכוכית על הבמה מיקרוסקופ. אתר מהמיקרו קפסולות באמצעות יעד 40 ×.
   3. לפנות את ידית מיקרוסקופ יציאת המצלמה. הירשם פלורסצנטיות שלהם עם ספקטרומטר. להפוך את הידית בחזרה אל עיניות.
      הערה: ודא כי האות ספקטרלי הוא הרבה מעבר לרמת הרקע ולהבטיח כי מהמיקרו קפסולות של שדה הראייה אינם בבועה (על-ידי המעבר הגדלה נמוכה במידת הצורך). הימנע תאורה ממושך של אותו מהמיקרו קפסולות. SNARF-1 הוא רגיש photobleaching.
   4. חזור על צעד 2.2.3 10 - 15 פעמים מהמיקרו קפסולות שונות.
3. לחשב את יחס שיא קרינה פלואורסצנטית (לדוגמה, שימוש R או Scilab) עבור כל ספקטרום רשום ולקבוע קו הרגרסיה בין יחס החציוני (עבור כל מאגר) בינוני pH באמצעות הנוסחה הבאה:
   
   הערה: SNARF-1 יש קשת עם שתי הפסגות התואם פליטת לצבוע protonated ו- deprotonated, היחס בין הפסגות מגיבים ה-pH של המדיום. במחקר זה, משמש היחס בין עוצמת קרינה פלואורסצנטית עבור 605, 660 ננומטר. אורכי גל אלה נבחרו בהתאם לקבוצת מסנן בשימוש. ו- b הם המקדמים שייקבעו ע י רגרסיה ליניארי (לדוגמה, שימוש R). הערכים 0.15 ו- 1.1 הם, בהתאמה, ערכי המינימום והמקסימום של אני605/I₆₆₀ נצפתה במהלך הכיול.
4. לאסוף 10 µL של דם דגים כ 5 חיות למבוגרים. המקום דגים לתוך צלחת פטרי עם µL 1/מ"ל מים השעיה של שמן ציפורן על הרדמה ולחכות עד החיה מסתובב על צידה, מפסיק להגיב קמצוצים הסנפיר (בדרך כלל ~ 2-3 דקות). להעביר את הדג על משטח זכוכית. לנתק את הזנב דגים עם אזמל מנתחים ולאסוף כ 2 µL של דם דגים מן הווריד של הזנב.
   הערה: כדי למנוע קרישת הדם, לטיפול החתך עם הפרין (5000 U/mL) ולהשתמש נימים זכוכית heparinized וצינורות microcentrifuge כדי לאסוף את הדם.
   1. לטפטף בערך 10 µL של דם עם פיפטה אל קצה microelectrode ולקבוע את ה-pH באמצעות מד pH.
   2. זרוק את הדם לשקופית עם מהמיקרו קפסולות מיובשים ולרשום את היחס של עוצמת קרינה פלואורסצנטית כמתואר על המאגרים כיול (שלבים 2.2-2.3).
5. התאם את מקדם ליניארי של עקומת כיול כדי להפוך את עקומת להתאים את המידות בדם דגים (עבור פרטים נוספים ראה Borvinskaya et al. . 2017⁵).

3. הכנה הזרקה

1. שחרר את המחט פלדה מהקצה של עט אינסולין (או מזרק) על-ידי הסרת הפלסטיק עם אזמל מנתחים חדה.
   הערה: כל מחט דקה (Ø0.33 מ מ או פחות) או יכול להיות מוכנים נימי זכוכית (בדרך כלל Ø1 מ"מ) microinjection^10,11.
2. להכניס את המחט בחצי הדרך microcapillary זכוכית; במהירות ובעדינות הלחמה אותו באמצעות מבער גז.
3. לחבר את microcapillary זכוכית microinjector ולא לשטוף את זה עם מים סטריליים שלוש פעמים. ודא כי הנוזל זורם דרך המחט.
4. למלא את המערכת עם מים מזוקקים.
   הערה: ודא כי קיימים אין בועות בתוך המערכת.

4. הזרקה

1. Resuspend על השעיית מהמיקרו קפסולות מוכן (סטרילי 0.9% NaCl או לכל מדיה אחרת המשמשים הזריקות, עם ריכוז של 0.5 ל 6 מיליון פרצת לכל microliter) באמצעות האמבט קולי עבור 1 דקות.
   הערה: מאז מהמיקרו קפסולות נוטים לזרז, במהלך הזריקה הבאה, לנער את המבחנה עם מהמיקרו קפסולות מכנית (באמצעות רוטור) או באופן ידני כל כמה דקות כדי resuspend אותם ולמנוע צבירת שלהם.
2. מניחים את הדג לתוך צלחת פטרי עם הרדמה (0.1 מ"ל/ליטר של שמן ציפורן מושעה במים) עבור ~ 2-3 דק. חכה עד הדגים מסתובב על צידה, מפסיק להגיב קמצוץ אור של הסנפיר.
3. בעזרת כפית, להעביר את הדג מהאגף ההרדמה ומניחים בעדינות אותו על ספוג לח במצב לרוחב עם הראש לכיוון השמאל (עבור אדם ימני) או לכיוון ימין (לאדם שמאלי).
4. לפני הזריקה, למצוץ 1-2 מ מ של אוויר לתוך כוס נימי קשור microinjector. אז, לעזאזל עם µL כ- 2 של מהמיקרו קפסולות התפזרו.
   הערה: לפני הזריקה, הפתרון microcapsule חייב להיות מותאם לטמפרטורה שבה נשמרים הדג.
5. בעדינות לייצב את הגוף של הדג על הספוג ביד האחרת.
   1. למצוא את קו הצד של הדג. נפשית בחר מקטע המרחיבה operculum לסופו של חלל הבטן. למצוא את האמצע של קטע זה. לשים את המחט 1 מ מ נמוך יותר כיוון הגחון.
   2. עם תנועה מגרד, להניע בעדינות הדג קשקשים הצידה, וגם לעשות נקב. הכנס את המחט לתוך הגוף בזווית של 45 מעלות על פני השטח בטבלה.
   3. דחוף את המחט לכיוון עמוד השדרה עד שתוצב בקפידה נגד זה.
   4. שחרור כ 1 µL של ההשעיה של מהמיקרו קפסולות לתוך הכליה, לאט לאט למשוך את המחט.
      הערה: כדי למצוא את החדירה נכונה בקלות רבה יותר, שימושי לאימון מציאת עורק הכליה על ידי transilluminating הדגים באמצעות אור למטה, כפי שמוצג 2A ו- 2B.
6. לשטוף את הדג מהראש אל הזנב עם זרם מים כדי להסיר כל מהמיקרו קפסולות שנשפך באתר הזרקת.

5. להדמיה in Vivo

1. להשתמש את המספריים לנתיחה כדי להסיר את מכסה הזימים ראש דג, מערטל את הזימים של דג. שטוף הזימים עם מים.
2. בעזרת כפית, להעביר את הדג על שקופית מיקרוסקופ, ומניחים אותו על השלב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
   הערה: ודא כי הגג של הדג לא יתייבש במהלך הליכי רצופים. כדי למנוע זאת, מדי פעם להרטיב אותן עם מים באמצעות פיפטה של פסטר (כ כל דקה 1-2).
3. להכהות את החדר, באמצעות הגדלה נמוכה (x 10 המטרה) לבדוק הזימים למצוא מהמיקרו קפסולות פלורסנט.
   הערה: כאשר ההליך משמשת היכרות ראשונית של כמה חלקיקים פלורסנט לתוך מערכת הדם דגים, מומלץ לבחון זימים של כמה אנשים עבור חלקיקים פלורסנט לא צפוי לפני זריקות. זימים של פראי-סוג דג זברה autofluorescence, אך במקרים מסוימים חלקיקים פלורסנט ספורדי (כמו חתיכות אוכל או אנחנו חיים איתם בסמביוזה חד־תאיות) עשוי להיות נוכח על הזימים. אם יש צורך, חלקיקים כאלה ניתן לזהות המבוססת על צורתם ספציפי (לדוגמה, חתיכות אוכל יש צורה לא סדירה, בניגוד מהמיקרו קפסולות כדורית) או ספקטרום קרינה פלואורסצנטית (קרי, צבע).
   1. לעבור את העדשה גבוה יותר בסולם ריכטר (המטרה × 40), והצב את microcapsule או קבוצת מהמיקרו קפסולות במרכז שדה הראייה.
   2. לפנות את הידית היציאה עם ספקטרומטר מחוברים. להקליט את האות ספקטרלי.
   3. להפוך את הידית בחזרה אל העינית.
   4. חזור על המדידות מספר פעמים מהמיקרו קפסולות שונות.
4. להעביר את הדגים באקווריום עם אוורור נאות להתאוששות.
   הערה: עם אימון מינימלי, זה אפשרי לבצע את ההזרקה ושידור הקלטת בשיעור מקורב של 2-3 דקות לכל דג. ניתן לחזור על המדידה עבור אחד מספר פעמים בודדות עם השימוש במינון נמוך, לא מזיק חוזרות ונשנות של הרדמה או שיטה אחרת של קיבעון. להשגחה לטווח ארוך, להשתמש במערכת עם הרדמה רציפה¹².

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

התוצאות שהושג בא מאחד לשלוש קטגוריות עיקריות של פרוטוקול שהוצגו: היווצרות של פלורסנט microparticles על ידי ומגעים צבע פלורסנט (איור 1), הזרקה כליות של מהמיקרו קפסולות עם עוד יותר את הפריט החזותי גיל נימים (איור 2 ו 3) וההקלטה, בסו?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כדי להדגים את הזריקה של microparticles לתוך הכליה דג זברה, השתמשנו חדיר למחצה מהמיקרו קפסולות עמוסה של אינדקטור. כך, הפרוטוקול מכיל הוראות להרכבת מהמיקרו קפסולות באמצעות מכלול שכבה אחרי שכבה טעונה הפוך polyelectrolytes^7,8,15,16,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescent probe
Calcium chloride	SIGMA	C1016	CaCO3 templates formation
Sodium carbonate	SIGMA	S7795	CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride	SIGMA	S8776	To dissolve applied polymers
Water Purification System	Millipore	SIMSV0000	To prepare deionized water
Magnetic stirrer	Stegler		For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL	F.L. Medical	28093	Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner			To reduce microcapsule aggregation
Head phones			To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	EDS	To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate	SIGMA	S9638	Preparation of pH buffers
Disodium phosphate	SIGMA	S9390	Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide	SIGMA	S8045	To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber			To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber			To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2	LOMO		In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)	Chroma	79010	Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide	Fisherbrand	12-550-A3	Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	To collect fish blood
Clove oil	SIGMA	C8392	Fish anesthesia
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode	Mettler Toledo		To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	For injection procedure
Gas torch			To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene	SIGMA	P5481	For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon			For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge			For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors	Thermo Scientific	31212	To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL	BRAND	Z331767	To moisten fish gills