Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

Özet

Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

Özet

Canlı bir organizma içine mikro büyüklükteki parçacıkların yönetim sistemik damarlara görselleştirme, ilaç ve aşı teslim, transgenik hücreleri ve küçük optik sensörler implantasyonu için uygulanabilir. Ancak, biyolojik ve veteriner laboratuvarları çoğunlukla kullanılan, küçük hayvanların içine intravenöz microinjections çok zor ve eğitimli personel gerektirir. Burada, biz balık böbrek içine enjeksiyon tarafından microparticles giriş yetişkin zebra balığı (Danio rerio) dolaşım sistemi içine için sağlam ve verimli bir yöntem göstermek. Damarlara tanıtılan microparticles görselleştirmek için balık solungaçları basit bir intravital görüntüleme tekniği öneriyorum. Vivo zebra balığı kan pH kontrolü başarılı bir enjekte microencapsulated floresan kullanarak sonda, SNARF-1, açıklanan tekniği mümkün uygulamalarından birini göstermek için. Bu makalede pH duyarlı boya encapsulation ayrıntılı bir açıklamasını ve hızlı enjeksiyon prensipleri ve görselleştirme floresan sinyali VIVO içinde kayıt için elde edilen microcapsules gösterir. Enjeksiyon önerilen yöntemi düşük mortalite oranı ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır. Tüm açıklanan yordamları süs balıkları ve medaka gibi diğer küçük balık türleri üzerinde gerçekleştirilebilir.

Giriş

Mikro büyüklükteki parçacıklar yönetim hayvan bir organizma içine ilaç ve aşı teslim¹, damarlara görselleştirme², transgenik hücre implantasyonu³ve küçük optik sensör implantasyon gibi alanlarda önemli bir görevdir ^{4 , 5}. ancak, implantasyon yordam microscale parçacıklar halinde küçük Laboratuvar hayvanlarının damar sistemi için özellikle hassas Sucul organizmalar için zordur. Zebra balığı gibi popüler araştırma numuneler için bu tavsiye edilir bu yordamları açıklık video protokollerini kullanarak.

İntrakardiyak ve kapiller microinjections'microobjects dır zebra balığı kana eğitimli personel ve benzersiz mikrocerrahi özellikleri gerektirir. Daha önce bir retro-orbital el ile enjeksiyon³ tüm hücreleri yönetim için kolay ve etkili bir yöntem olarak önerilmiştir. Ancak, deneyim, göz kılcal ağ küçük alanı nedeniyle bu teknik üzerinden istenilen sonucu elde etmek için çok pratik alır.

Burada, biz güçlü ve verimli microparticle implantasyon dolaşım sistemi içine için bir yöntem yetişkin zebra balığı, böbrek dokusunun içine doğrudan el ile enjeksiyonla kılcal damar ve böbrek damarlarının açısından zengin olduğu açıklanmaktadır. Bu teknik zebra balığı böbrek⁶içine hücre transplantasyonu için video protokolünü dayanır ama travmatik ve zaman alıcı mikrocerrahi adımları elendi. Önerilen yöntem tarafından düşük mortalite ile karakterizedir (0-%20) ve yüksek verimlilik (% 70-90 başarı) ve yaygın olarak bulunan cihazlar kullanılıyor Enstitü kolaydır.

Hangi enjeksiyon kalite, sayısı bir kaba göreli değerlendirme doğrulanmasına izin verir (floresan veya renkli olmaları durumunda) implant microparticles gill kılcal damarlar içinde görselleştirme önerilen protokol önemli bir parçası olduğunu enjekte parçacıklar ve dolaşımdaki kandan doğrudan fizyolojik ölçümler için spektral sinyal algılama. Açıklanan tekniği olası uygulamaları bir örnek olarak, biz SNARF-1, ilk olarak önerilen Borvinskaya bir microencapsulated floresan sonda kullanarak zebra balığı kan pH vivo ölçümleri için protokol göstermek ve ark. 2017⁵.

Protokol

Tüm deneysel yordamlar AB Direktifi 2010/63/AB hayvan deneyleri için uygun olarak yapılmıştır ve hayvan konularda araştırma komitesi, Enstitüsü biyoloji Irkutsk State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Microcapsules imalatı

Not: bir floresan boya taşıyan Microcapsules ters şarj edilmiş polyelectrolytes^7,8katman katman Meclisi kullanarak hazırlanır. Tüm yordamları oda sıcaklığında yapıldı.

1. Gözenekli CaCO₃ microcores floresan boya kapsayan sentezlemek için 2 mL (çoğu polimer bağlı floresan boya FITC-BSA gibi kullanılabilir) SNARF-1-dextran çözeltisi ~ 2 mg/mL konsantrasyonu 0.6 mL ile her biri 1 mol/L çözümleri CaCl_{2, mix} ve Na₂CO₃ hızlı karıştırma altında.
   Not: floresan boyalar farklı hassasiyetleri photobleaching için dikkat; bir ışığa duyarlı floresan sonda (gibi SNARF-1) kullandıysanız, işleme ve depolama microparticles ile mümkün olduğunca az ışık olarak gerçekleştirilmelidir.
2. Sonra 5-10 s ajitasyon, süspansiyon 2 mL microcentrifuge tüpler ve santrifüj 15 transfer 10.000-12.000 CaCO₃ microcores cips için g, s.
3. Süpernatant atmak, çekirdek ~ 2 mL deiyonize su ile yıkayın ve Pelet sallayarak resuspend.
4. Toplamda üç kez Santrifüjü yıkama yordamı yineleyin. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
5. Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
   Dikkat: kulak kulaklık ile korumak unutmayın.
6. İlk polimer katman şablonlar yatırmak için ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik poly(allylamine hydrochloride) (PAH) 1 mol/L NaCl içinde çekirdek resuspend.
   1. Microcores ~ 5 dakika sürekli sallayarak ile çözüm unutmayın.
   2. 15 sonra Santrifüjü, s süpernatant ilişkisiz PAH ile atmak. Kapalı microcores en az 3 kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü ve adımları yıkama deiyonize su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
   3. Microcores onların toplama azaltmak için bir ultrasonik banyo 1 dk. için kuluçkaya.
      Not: Uygulamalı floresan boya katyonik ise, poli (sodyum 4-styrenesulfonate) başlatma (PSS) ın 1 mol/L NaCl (bkz. Adım 1.7).
7. 1.6 ~ 2 mL bir 4 mg/mL lik (Ayrıca 1 mol/L NaCl içeren) PSS ile ikinci polimer tabaka şablonlar yatırmak için adımları yineleyin.
8. 12 polimer kat yatırmak için 1,6 ve 1.7 altı kez adımları yineleyin.
   Not: Bu uzun bir aradan (~ 12 saat veya daha fazla) almak için tavsiye edilmez çünkü CaCO₃ microcores kapsama olmadan Li2 eğilimi ~ 3-5 kadar yordamdaki katmanları yatırılan. Not PSS kapsama microcores daha yüksek bir toplama neden olur ve uzun sessizlik (PLL-g-PEG) sadece PAH veya poli-L-lizin Polietilen glikol ile aşılı dıştaki katman olduğunda önerilir.
9. Kapalı microcores 2 mg/ml PLL-g-PEG (~ 1 mL microtube başına) en az 2 h için kuluçkaya.
   1. Microcores sıralı Santrifüjü ve resuspension adımları üzerinden su ile yıkayın. Son Santrifüjü sonra süpernatant atmak.
10. İçi boş microcapsules elde etmek için CaCO₃ şablonlar 2 mL (pH 7.1 NaOH ile düzeltilmiş) 0,1 mol/L ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyerek kapalı microcores geçiyoruz.
    1. Microcapsules 45 s ve atma, kuluçka ~ 5 dk sonra santrifüj kapasitesi süpernatant EDTA ile.
    2. 1.10-1.10.1 adımları iki kez tekrarlayın.
11. Microcapsules % 0,9 NaCl üç kez aracılığıyla birden çok Santrifüjü adımlar içinde 45 ile yıkayın s takip adımlar yıkayarak. Son Santrifüjü adımdan sonra süpernatant atmak.
    Not: Son microcapsule çözüm enjeksiyon için (örneğin ampisilin, 0.1 mg/mL ekleyerek) steril tutulmalıdır ve medya araştırma (izotonik ortam nötr pH ile) ile biyouyumlu olmalıdır.
12. Bir hemasitometre bir floresan mikroskop altında hazırlanan microcapsules konsantrasyonu tahmin ediyoruz. Microcapsules resimleri bir dizi, çapı yüz microcapsules ImageJ⁹ veya eşdeğer yazılım kullanma hakkında ölçmek ve bir çubuk grafik kullanarak boyutu dağıtım araştırmak.
13. Mağaza elde edilen karanlıkta prob kapsüllenir.
    Not: sonra birkaç yıkama steril % 0,9 NaCl, microcapsules ay 4 ° C'de depolanan Tam microcapsules depolama sırasında kurutma tavsiye edilmez.

2. Optik Kurulum ve kalibrasyon mikroenkapsüle SNARF-1'in hazırlanması

Not: Kaba pH ölçümleri mikroenkapsüle SNARF-1 ile floresan mikroskop⁷iki kanallarında görüntüleri kullanılarak yapılabilir, ancak tek kanallı floresan mikroskop fiber spektrometre için bağlı bu protokolü uygulandı.

1. Floresan filtre uygulanan floresan boya özelliklerine göre floresan mikroskop için gerekli kümesi yerleştirin ve floresan lamba açmak.
   1. Kolu göz mercekleri için çekin.
      Uyarı: Aşırı ışık Spektrometre matris zarar verebilir. Böylece, spektrometre kullanılmadığında kolu "mercek" modunda olduğundan emin olun.
   2. Fiber optik bir ucunu Spektrometre ve bir kolimatör diğer ucunu bağlayın. Bağdaştırıcıları kullanarak, Kolimatör kamera tüpü odak veya floresan mikroskop diğer kullanılabilir bağlantı noktası ekleyin.
   3. Spektrometre üzerinde açın. Spektrometre denetim programını çalıştırıp Spektrometre ölçümleri için hazırlamak.
2. Microcapsule toplu kalibrasyonunun ~ 5 µL microcapsule süspansiyon (~ 10 000 microcapsules µL deiyonize su başına), mikroskop slaytta yer ve karanlık bir yere (örneğin, bir termostat 35 ° c) içinde belgili tanımlık damla kuru.
   1. Microencapsulated SNARF-1 spektral özellikleri ayarlamak için bir dizi arabellekleri ~ 6-9 aralığındaki farklı pH değerleri kullanın. ~ 10 µL SNARF-1-dextran ile kurutulmuş microcapsules üzerine bir arabellek bırak ve bir coverslip ile kaplayın.
   2. Cam slayt mikroskop sahnesinde yerini. × 40 amacı istimal microcapsules bulun.
   3. Mikroskop kolu kamera bağlantı noktasına çevirin. Onların Floresans Spektrometre ile kayıt. Göz mercekleri başa kolu çevirin.
      Not: spektral sinyal çok arka plan düzeyinin sağlayın ve görüş alanı içinde microcapsules bir balonun içinde (daha düşük bir boyuta gerekirse geçiş yaparak) olmadığından emin olun. Aynı microcapsules uzun süreli aydınlatma kaçının. SNARF-1 için photobleaching duyarlıdır.
   4. 2.2.3 farklı microcapsules için 10 - 15 kez yineleyin.
3. Floresan en yüksek oranları (örneğin, R veya Scilab kullanarak) hesaplamak için tüm kayıtlı spectra ve medyan oranı (için her arabellek) ve aşağıdaki formülü kullanarak orta pH arasındaki regresyon çizgisini belirler:
   
   Not: SNARF-1 ile iki doruklarına protonated ve deprotonated boya emisyon için karşılık gelen bir spektrum vardır ve tepeler arasındaki oran orta pH cevap veriyor. Bu çalışmada, 605 ve 660 nm floresan yoğunluğu arasındaki oranı kullanılır. Bu dalga boyu kullanılan filtre kümesini bağlı olarak seçilir. a ve b (örneğin, R kullanarak) doğrusal olmayan regresyon belirlenecek katsayıları vardır. 0,15 ve 1.1 değerlerdir, sırasıyla, minimum ve maksimum değerlerini ben605/i₆₆₀ kalibrasyon sırasında gözlenen.
4. Balık kan yaklaşık 10 µL yaklaşık 5 Yetişkin hayvanlardan toplamak. Yer balık Petri kabına 1 µL/mL ile içine su karanfil yağı anestezi için süspansiyon ve hayvan yan döner ve fin pinch için yanıt vermiyor kadar bekleyin (genellikle ~ 2-3 dk). Balık bir cam slayt üzerinde aktarın. Balık kuyruğu lanset ile kesti ve kuyruk damar yaklaşık 2 µL balık kan toplamak.
   Not: kan pıhtılaşma önlemek için heparin (5000 U/mL) ile belgili tanımlık kesme tedavi ve heparinized cam kılcal damarlar ve microcentrifuge tüpler kan toplamak için kullanın.
   1. Yaklaşık 10 µL kan elektrot ucunu üzerine bir pipet ile damla ve pH pH-metre kullanarak belirleyebilirsiniz.
   2. Kan kurutulmuş microcapsules ile bir slayt üzerine bırakın ve kalibrasyon arabelleklerini (adım 2.2 2.3) açıklandığı gibi floresan yoğunluğu oranı kayıt.
5. Eğri (için daha fazla ayrıntı bkz: Borvinskaya ve ark. 2017⁵) balık kanı ölçümlerde maç yapmak için kalibrasyon eğrisi doğrusal katsayısı ayarlayın.

3. hazırlık enjeksiyon için

1. Çelik iğne ucu keskin lanset ile plastik kaldırarak insülin kalem (veya şırınga) yayın.
   Not: Herhangi bir ince iğne (Ø0.33 mm veya daha az) veya cam kılcal (genellikle Ø1 mm) mikroenjeksiyon^10,11için hazırlıklı ol.
2. İğneyi yarıya kadar cam microcapillary yerleştirin; hızlı ve yavaş bir gaz meşale kullanarak lehim.
3. Cam microcapillary için microinjector bağlamak ve üç kez steril su ile yıkayın. Sıvı iğne akar emin olun.
4. Sistem distile su ile doldurun.
   Not: sistemde hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.

4. enjeksiyon

1. Microcapsules hazırlanan süspansiyon resuspend (steril % 0.9 NaCl veya diğer medya kullanılan 0.5 ila 6 milyon microcapsules microliter başına bir konsantrasyon ile enjeksiyonlar için) için 1 dk ultrasonik banyo kullanarak.
   Not: microcapsules, aşağıdaki enjeksiyon sırasında çökelti eğilimindedir bu yana şişeyi microcapsules ile mekanik sallamak (bir rotor kullanarak) veya el ile her birkaç dakikada onları resuspend ve onların toplama önlemek için.
2. ~ 2-3 için bir petri anestezi (0.1 mL/L karanfil yağı suya askıya) ile içine balık yer dk. kadar bekleyin balık yan döner ve fin hafif bir tutam yanıt vermiyor.
3. Bir kaşık kullanarak, anestezi çıkmış balık aktarmak ve yavaşça (sağ elini kullanan kişi için) sola doğru veya (sol elli kişi için) sağa doğru kafa ile yanal bir konumda nemli bir sünger üzerine yerleştirin.
4. Sadece enjeksiyon önce 1-2 mm cam kılcal damar içine hava microinjector ile bağlı emmek. O zaman, dağınık microcapsules yaklaşık 2 µL ile yük.
   Not: enjeksiyon önce microcapsule çözüm hangi balık tutulur sıcaklık ayarlanması gerekir.
5. Yavaşça sigara dominant el ile sünger balık gövdesini stabilize etmek.
   1. Sonradan içini kaplamak balık bulmak. Zihinsel genişleten bir kesimi operculum karın boşluğu sonuna kadar seçer. Bu segmentteki ortasını bulmak. İğne 1 mm daha düşük ventral yönde koymak.
   2. Kazıma bir hareketi, yavaşça balık bir kenara ölçekler ve bir delik yapmak hareket. Tablo yüzeye 45 ° açılı ve vücuda iğne yerleştirin.
   3. Dikkatli bir şekilde buna karşı aittir kadar iğne omurga doğru itin.
   4. Microcapsules süspansiyon yaklaşık 1 µL böbrek bırakın ve yavaş yavaş iğne tutar.
      Not: uygun delik site bulmak için daha kolay, pratik Şekil 2A ve 2B'yigösterildiği gibi bir alt ışık kullanarak balıklar transilluminating tarafından gövde böbrek bulmak için yararlıdır.
6. Enjeksiyon yerinde dökülmüş herhangi bir microcapsules kaldırmak için su akışı ile kuyruk başından balık durulayın.

5. içinde Vivo görselleştirme

1. Balık baştan gill kapağını çıkarın ve balık solungaçları denude için diseksiyon makası kullanın. Solungaçları su ile durulayın.
2. Bir kaşık kullanarak, balık mikroskop slayda aktarmak ve floresan mikroskop sahnesinde yerini.
   Not: balık solungaçları ardışık işlemler sırasında kurumasına olduğunu emin olun. Bunu önlemek için düzenli olarak onları nemlendirin su Pasteur pipet (yaklaşık her 1-2 dk) kullanarak.
3. Odayı karartmak ve düşük büyütme (x 10 amaç) kullanarak floresan microcapsules bulmak için solungaçları inceleyin.
   Not: balık dolaşım sistemi içine bazı floresan parçacıkların giriş için yordam kullanıldığında, solungaçları, birkaç bireylerin enjeksiyonları önce beklenmedik floresan parçacıklar için incelemek için önerilir. Vahşi-türü zebra balığı solungaçları autofluorescence yok ama bazı durumlarda sporadik floresan parçacıklar (gıda parçaları veya tek hücreli simbiont) solungaçları üzerinde mevcut olabilir. Gerekli, bu tür parçacıklar belirli şekilleri göre kabul edilebilir eğer (örneğin, gıda adet düzensiz şekli, küresel microcapsules aksine var) veya floresan spektrum (Yani, renk).
   1. Objektifin daha yüksek bir büyüklük (× 40 amaç) geçin ve bir microcapsule veya microcapsules bir grup görüş alanı ortasına yerleştirin.
   2. Yandaki bağlantı noktasına bağlı bir Spektrometre ile açmak. Spektral sinyal kaydedebilir.
   3. Mercek için geri kolu çevirin.
   4. Ölçümler için farklı microcapsules birkaç kere tekrar edin.
4. Balık akvaryum kurtarma için uygun havalandırma ile aktarın.
   Not: en az uygulama ile enjeksiyon ve 2-3 dk balık başına yaklaşık bir oranda kayıt sinyal yapmak mümkündür. Ölçüm bir bireysel birkaç kez anestezi tekrarlanan zararsız, düşük doz veya başka bir yöntemi fiksasyon kullanımı ile tekrar edilebilir. Uzun vadeli gözlem için bir sistem ile sürekli anestezi¹²kullanın.

Sonuçlar

Elde edilen sonuçları sunulan Protokolü üç ana kategoride birinden gelir: bir floresan boya (Şekil 1), microcapsules daha fazla görselleştirme ile böbrek enjeksiyon encapsulation tarafından floresan microparticles oluşumu Gill kılcal damarlar (Şekil 2 ve 3) ve pH seviyeleri (Şekil 4) kan son olarak, in vivo spektral kayıt SNARF-1 floresans iz...

Tartışmalar

Microparticles enjeksiyon zebra balığı böbrek içine göstermek için yarı geçirgen microcapsules bir göstergesi boya ile yüklenen kullanılmıştır. Böylece, iletişim kuralı kullanarak katman katman derleme ters şarj edilmiş polyelectrolytes^{7,8,15,16,17 microcapsules imalatı için yönergeler içerir ,18} (

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescent probe
Calcium chloride	SIGMA	C1016	CaCO3 templates formation
Sodium carbonate	SIGMA	S7795	CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride	SIGMA	S8776	To dissolve applied polymers
Water Purification System	Millipore	SIMSV0000	To prepare deionized water
Magnetic stirrer	Stegler		For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL	F.L. Medical	28093	Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner			To reduce microcapsule aggregation
Head phones			To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	EDS	To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate	SIGMA	S9638	Preparation of pH buffers
Disodium phosphate	SIGMA	S9390	Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide	SIGMA	S8045	To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber			To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber			To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2	LOMO		In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)	Chroma	79010	Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide	Fisherbrand	12-550-A3	Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	To collect fish blood
Clove oil	SIGMA	C8392	Fish anesthesia
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode	Mettler Toledo		To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	For injection procedure
Gas torch			To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene	SIGMA	P5481	For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon			For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge			For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors	Thermo Scientific	31212	To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL	BRAND	Z331767	To moisten fish gills