التقوية لكفاءة جسم السرطان بالعقاقير أنتينيوبلاستيك: الكشف عن التآزر جسم-المخدرات باستخدام معادلة الجمع بين مؤشر

Summary

ويصف هذا البروتوكول كيفية تقييم التآزر بين جسم السرطان والأدوية أنتينيوبلاستيك في نماذج السريرية باستخدام معادلة مؤشر الجمع بين تشو وتالالاي.

Abstract

التقوية مونوكلونل معادية (ماب) من وكلاء العلاج الكيميائي يشكل استراتيجية قيمة لتصميم العلاج فعالة وأكثر أماناً ضد السرطان. هنا نقدم بروتوكول لتحديد مجموعة رشيد في الخطوة الإكلينيكية. أولاً، يصف لنا تحليل يستند إلى الخلية لتقييم التآزر بين ماب السرطان والعقاقير السامة للخلايا، ويستخدم معادلة مؤشر تركيبة شو وتالالاي¹. ويشمل هذا القياس لورم الخلية المخدرات-الأجسام المضادة-حساسية واستخدام مقايسة MTT، يليها تحليل الحاسوب الآلي لحساب قيم الفهرس (CI) الجمع بين. قيم CI < 1 تشير إلى التآزر بين مابس المختبرة ووكلاء السامة للخلايا¹. للتأكد من صحة في المختبر النتائج التي توصل إليها في فيفو، يصف لنا كذلك وسيلة لتقييم فعالية نظام الجمع في نموذج ورم xenograft. في هذا النموذج، يؤخر النظام إلى حد كبير نمو الورم، مما يؤدي بقاء موسعة كبيرة بالمقارنة مع عامل واحد عناصر التحكم. الأهم من ذلك، والتجريب في فيفو يكشف أن نظام الجمع هو جيد التحمل. يسمح هذا البروتوكول للتقييم الفعال لتركيبات المخدرات السرطان في نماذج السريري وتحديد تركيبة عقلانية لتقييم في التجارب السريرية.

Introduction

وكان النهج التقليدي في علاج عدد كبير من أنواع مختلفة من السرطان استناداً إلى الأحادي. حتى ولو أنه يزال يستخدم في كثير من الحالات، اجتمع هذا الأسلوب العديد من العوائق التي تؤدي إلى اختيار العلاجات المجمعة². وخاصة الخلايا السرطانية أكثر عرضه لتطوير المقاومة عندما تعامل مع دواء واحد بحمل بديلة بقاء الآليات³، مما تسبب في تعطل العلاجية في مرضى⁴. وعلاوة على ذلك، هي المخدرات في الأحادي، وعادة ما تدار بجرعة عالية. هذه الحالة كثيرا ما ينتج عن حدوث الآثار الجانبية تعتمد على جرعة قوية يمكن لا تطاق وإجبار الأطباء بوقف العلاج². لهذه الأسباب، الرابطة لجزيئات السرطان الآن يفضل الأحادي.

مزيج مثالي من المخدرات ستكون تلك التي تعمل في تضافر الجهود ضد الخلايا السرطانية، دون زيادة السمية ضد الخلايا الطبيعية. ويشير التآزر للتفاعل بين اثنين أو أكثر من المخدرات التي تنتج تأثير علاجي أكبر من مجموع كل العقاقير فردية تعمل بشكل منفصل. قد يؤدي مثل هذه التفاعلات في تعزيز الفعالية العلاجية السريرية². يحد من مقاومة العلاج، ويزيد من فعالية، ويمكن أيضا تقليل سمية². وفي الواقع، يمكن تخفيض الجرعة لكل دواء لتقليل آثارها الجانبية التي تستهدف مسارات مختلفة. وبالإضافة إلى ذلك، واحدة من الجزيئات يمكن أن تخدم أيضا كعامل توعية ضد الخلايا السرطانية. تأثير المخدرات الثانية وقد تتعزز في خلايا توعية وجرعات أقل يمكن استخدامها⁵.

يمكن أن تشمل العلاج بالجمع بين اثنين أو أكثر من المخدرات العلاج الكيميائي أو البيولوجي، مثل [مونوكلونل]⁶. هذه مابس تستهدف على وجه التحديد خلايا معربا عن خلية للمستضد سطحي للفائدة، وهي قادرة على قتل الخلايا السرطانية من خلال مسارات المناعية بما في ذلك تعتمد على جسم الخلية بوساطة سيتوتوكسيسيتي (ADCC)، بمشاركة الخلايا المناعية المستجيب ⁷، وتعتمد على تكملة سيتوتوكسيسيتي (CDC)⁶. أنها يمكن أن تعمل أيضا عبر إليه غير مناعية توسط المبرمج^8،9،،من¹⁰¹¹. في هذه الحالة، قد تقلد عملية موت الخلايا المبرمج توعية الخلايا السرطانية وتضعف وظيفتها وتزيد من فعالية العلاج الكيميائي المخدرات المرتبطة بها في جرعة أقل. على هذا النحو، تعتبر ماب بروابوبتوتيك مرشحا جيدا لتصميم نظم تركيبة مع الأدوية أنتينيوبلاستيك.

وقد وصف مختلف النماذج الرياضية لتقييم التآزر المخدرات؛ واحد منهم يستند إلى الجمع بين مؤشر الأسلوب¹. هذا الأسلوب يستند إلى مبدأ الوسطية-تأثير وضعتها شو¹. معادلة تأثير متوسط يرتبط بجرعة المخدرات وأثر المخدرات على النحو التالي.

وهنا هي د جرعة المخدرات؛ مارك ألماني هو تأثير متوسط الجرعة؛ اتحاد كرة القدم هو الكسر تتأثر الجرعة؛ m هو إس الذي يدل على شكل الأرض تأثير الجرعة¹. متوسط-تأثير الجرعة يستخدم لحساب الجرعة Dx من الدواء الذي يمنع أو يقتل "x" في المئة من الخلايا. ثم يتم حساب قيمة CI لتقييم تأثير المواد المضافة للجمع بين المخدرات، على النحو التالي¹.

قيمة CI 1 يشير إلى تأثير المواد مضافة وقيمة CI < 1 يشير إلى تأثير تآزري، بينما قيمة CI > 1 يشير إلى العداء¹. تطبيق هذا الأسلوب هو زيادة تيسير توافر برنامج كمبيوتر، كومبوسين، الذي يحدد التآزر والعداء في كل جرعة أو مستويات تأثير محاكاة تلقائياً¹².

مجموعتنا الخاصة 8B6 ماب س-أسيتيل-GD2 جانجليوسيدي (OAcGD2) نيوروبلاستوما مستضد¹³ وكذلك أظهرت أن هذا ماب قادرة على الحث على موت الخلايا مع سمات المبرمج¹¹. لاختبار ما إذا كان يمكن توعية ماب 8B6 نيوروبلاستوما الخلايا توبوتيكان وكيل أنتينيوبلاستيك، نحن تكييف الأسلوب المذكورة أعلاه وضعتها شو¹. أولاً، علينا أن نحدد الجرعة الفعالة 50 (ED₅₀) قيم ماب 8B6 وتوبوتيكان. المقبل، تتعرض الخلايا نيوروبلاستوما مع نسب اكويبوتينت من المركبين استناداً إلى قيم₅₀ اد لتحديد قيم CI باستخدام برامج المحاكاة المذكورة أعلاه. هذا الأسلوب يسمح لنا بإظهار التآزر بين ماب 8B6 وتوبوتيكان في المختبر. وبعد ذلك، يصف لنا بروتوكولا لمواصلة تقييم الفاعلية وسلامة هذا الجمع بين نظام في فيفو. يمكن بسهولة تطبيق هذا البروتوكول لتحديد ماب السرطان قوية وآمنة وتركيبات عوامل العلاج الكيميائي في الدراسات الإكلينيكية. ويرد تمثيل تخطيطي لهذه الدراسة في الشكل 1.

Protocol

الإسكان الحيوان والإجراءات التجريبية بموافقة "الحكومة الفرنسية" (اتفاقات #C44-278 و #APAFIS 03479.01). رعاية الحيوان وإجراءات أجريت تحت توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي والقانون الفرنسي #2013-118 لحماية الحيوانات المستخدمة لأغراض البحث العلمي.

1-تقييم 8B6 "المخدرات التفاعل بين" الإنسان والمحيط الحيوي وتوبوتيكان في المختبر

1. إعداد عينة 96-جيدا
   تنبيه: التشاور مع لجنة الصحة والسلامة للمؤسسة، واتباع قواعد التنظيم المحلية المتصلة بسلامة المختبرات. استعراض المعلومات المادية وصحيفة بيانات السلامة قبل العمل مع أي وسائط الإعلام، وخطوط الخلية، أو الكواشف. استخدام أسلوب تعقيم السليم والعمل في غطاء الاندفاق الصفحي. يجب أن تكون جميع الحلول والمعدات التي تستخدم للتلاعب بخلايا عقيمة.
   ملاحظة: صمم بروتوكول التالية للاستخدام مع خلايا ملتصقة. التعديلات المطلوبة لتطبيق الأسلوب نوناديرينت الخلايا تنمو في التعليق؛ هذا البروتوكول يستخدم البيلوروسية لكل حالة تجريبية.
   1. تنمو خلايا IMR5 في قارورة T75.
   2. في اليوم الأول (يوم 0)، مراعاة ثقافة الخلية تحت مجهر للتحقق من كونفلوينسي الخلية. نضح المتوسطة الخلية من قارورة وغسله مع 5 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS)، وأضف 3 مل حمض الإيثيلين 0.05% (يدتا)/حل برنامج تلفزيوني. العودة قارورة للحاضنة لمدة 3 دقائق (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂).
   3. دراسة ثقافة الخلية تحت مجهر لمفرزة الخلية.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، العودة قارورة للحاضنة مين 3 إلى 5 إضافية، تبعاً لنوع الخلايا السرطانية.
   4. إضافة 10 مل من خلية كاملة المتوسطة قارورة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي عقيمة 15 مل. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 x ز. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
   5. إزالة وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط كاملة النمو. ضبط الحجم المتوسط للحصول على تركيز نهائي 1 × 10⁵ خلايا/مل.
   6. الآبار البذور 84 من صفيحة الثقافة 96-جيدا مع 10⁴ خلايا كل منها، وهو 100 ميليلتر من تعليق خلية. اتبع المخطط التجريبي المبين في الشكل 2.
   7. احتضان الخلايا ح 18 في الخلية الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂).
2. إعداد حل المخدرات
   ملاحظة: لدراسات التوعية بالمخدرات/ماب، تعديل التوقيت والطول، ومعاملة تركيز لتتناسب مع المخدرات/ماب خاصة في السؤال. لاحظ أن تركيز الأولى هو 3 × تركيز النهائي.
   1. في صباح اليوم التالي (اليوم الأول)، إعداد الحلول المخدرات التالية باستخدام متوسط النمو الكامل.
      1. إعداد الحل ماب
         1. تمييع ماب في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل الحصول على جسم عامل حل مع تركيز ماب 240 ميكروغرام/مل.
         2. أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
      2. إعداد حل توبوتيكان
         1. تمييع، وصفه أعلاه، المخدرات في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل للحصول على حل عامل المخدرات بتركيز نهائي من 120 نانومتر.
         2. أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
      3. إعداد حل جسم والمخدرات
         1. تمييع حلول المخدرات والإنسان والمحيط الحيوي في 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل للحصول على حل في 120 نانومتر المخدرات ومآب 240 ميكروغرام/مل (العامل الحل).
         2. أداء خمس تخفيف المسلسل شقين كما هو مبين في الشكل 2.
   2. للوصول إلى تركيز النهائي، نقل 50 ميليلتر من كل حل المخدرات إلى الآبار المناظرة، كما هو مبين في المخطط التجريبي ( الشكل 2).
      ملاحظة: نقل 50 ميليلتر من متوسط النمو الكامل في الآبار الخلايا غير المعالجة، كما هو مبين في الشكل 2.
   3. احتضان الخلايا ح 72 في الحاضنة (37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%₂).
3. فحص MTT
   1. إضافة 10 ميليلتر MTT كاشف الحل في كل بئر.
   2. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4.
   3. إضافة 100 ميليلتر من تحلل الحل (10% الحزب الديمقراطي الصربي في 0.01 M HCl) في كل بئر، استخدام ماصة متعددة القنوات، ومزيج دقيق من بيبيتينج.
   4. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 في دائرة هوميديفيد (95% رطوبة).
   5. قراءة امتصاص في 570 نانومتر (₅₇₀) و 620 نانومتر (₆₂₀) باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: خلط كل عينة مرة أخرى قبل بيبيتينج قبل قراءة امتصاص؛ امتصاص في 620 نانومتر يسمح تصحيح القيم الخلفية غير محدد.
   6. حساب امتصاص المصححة: تصحيح امتصاص = من₅₇₀-₆₂₀.
   7. حساب بقاء الخلية كالتالي: الخلية صلاحية = 100 x (عينة يعني امتصاص المصححة/التحكم يعني امتصاص المصوبة).
   8. حساب القيم المتأثرة بالكسر (اتحاد كرة القدم) باستخدام المعادلة التالية: 1-(عينة يعني امتصاص المصححة/التحكم يعني امتصاص المصوبة).
4. دراسات الجمع بين المخدرات والمخدرات التفاعل برامج المحاكاة التحليلية لواحد
   1. قم بتشغيل برنامج المحاكاة لفتح نافذة ابدأ.
   2. انقر فوق الزر التجربة الجديدة لفتح النافذة الرئيسية .
   3. اكتب الاسم للتجربة في إطار الاسم .
      ملاحظة: يمكن إضافة تاريخ في إطار التاريخ .
   4. انقر فوق الزر المخدرات واحدة جديدة .
   5. اكتب الاسم في إطار الاسم الكامل .
   6. اكتب الاختصار في إطار أبريف .
   7. اكتب وحدة تركيز المخدرات في إطار الوحدات .
   8. أدخل بيانات النقطة 1 الجرعة و قيمة فا، اضغط مفتاح الإدخال Enter.
   9. كرر هذه الخطوة حتى يتم إدخال كافة نقاط البيانات.
   10. انقر فوق الزر انتهى .
   11. اتبع نفس الخطوات لإدخال نقاط البيانات ماب.
       ملاحظة: استخدام نفس وحدة تركيز كما يستخدم من قبل المخدرات.
   12. انقر فوق الزر الجديد المخدرات التحرير والسرد .
   13. حدد المخدرات و الإنسان والمحيط الحيوي.
   14. تحديد نسبة ثابتة وانقر فوق موافق.
   15. اكتب الاسم في إطار الاسم الكامل .
   16. اكتب الاختصار في إطار أبريف .
   17. اكتب نسبة المخدرات/ماب في إطار نسبة .
   18. أدخل بيانات النقطة 1 الجرعة ، ثم اضغط Enter.
       ملاحظة: سيقوم البرنامج تلقائياً بحساب الجرعات للإنسان والمحيط الحيوي، والتحرير والسرد.
   19. قم بإدخال قيمة بيانات النقطة 1 اتحاد كرة القدم واضغط على Enter.
   20. كرر هذه الخطوة حتى يتم إدخال كافة نقاط البيانات.
   21. انقر فوق الزر انتهى ، وبعد ذلك، انقر فوق الزر إنشاء تقرير .
   22. حدد المخدرات والإنسان والمحيط الحيوي، ومن ثم انقر فوق موافق.
   23. حدد تحرير وسرد ، ومن ثم انقر فوق موافق.
   24. حدد رأس الجدول CI، و الجدول الموجز. ثم انقر فوق موافق.
   25. اكتب اسم ملف للملف تحليل ثم انقر فوق حفظ لإنشاء التقرير.
       ملاحظة: بعد النقر فوق موافق، سيتم تلقائياً فتح التقرير في مستعرض ويب الافتراضي الخاص بجهاز الكمبيوتر.
   26. لطباعة التقرير، اختر طباعة من القائمة ملف في مستعرض ويب. ويتضمن التقرير "مقطع الجدول الموجز" الذي يتضمن العنوان، التاريخ، اسم الملف، وملاحظة وصف، معلمات (m، مارك ألماني، والبحث والتطوير)، اد₅₀ عامل أما المستخدمة في الأحادي أو في تركيبة، والجدول CI لكل تركيبة في اد₅₀، اد ₇₅، اد₉₀و₉₅من اد.
       ملاحظة: قيمة CI من < 1 يشير إلى التآزر، قيمة CI = 1 يشير إلى الجمع، وقيمة CI > 1 يشير إلى العداء.

2-جيل تكثيفها نيوروبلاستوما البشرية في إيماءة السكري نونوبيسي غاما مشمولان الفئران (مجموعة موردي المواد النووية الفئران)

ملاحظة: استبعاد أي تلوث لثقافة الخلية. حيث المصفوفة الغشاء أشكال هلام أعلاه 5 درجة مئوية، وينبغي كل كولتوريواري أو وسائل الإعلام تأتي على اتصال الغشاء مصفوفة الكاشف بريشيليد والجليد-باردة. إبقاء المصفوفة الغشاء على الجليد خلال العملية بأكملها.

1. إعداد تعليق خلية IMR5
   1. ذوبان الغشاء مصفوفة الكاشف بين عشية وضحاها بغمر القنينة في الجليد في ثلاجة 4 درجة مئوية قبل الاستخدام.
   2. في اليوم 0، حصاد مثقف IMR5 الخلايا كما هو مفصل أعلاه.
   3. نقل الخلايا إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
   4. تجاهل المادة طافية. تغسل الخلايا 2 x مع 15 مل من برنامج تلفزيوني المثلج، وإعداد تعليق خلية من 5 × 10⁷ خلايا/مل في برنامج تلفزيوني المثلج.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، نقل تعليق خلية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
   5. دوامة القنينة مصفوفة غشاء الطابق السفلي.
      ملاحظة: ينبغي إذابة الغشاء مصفوفة الكاشف ومشتتة.
   6. إضافة مجلد واحد من الغشاء مصفوفة الكاشف ومزجها بيبيتينج للحصول على تعليق خلية 2.5 × 10⁷ خلايا/mL.
   7. ستبقى على تعليق خلية على الجليد.
2. إعداد الفئران
   ملاحظة: يجب أن تكون الفئران ستة إلى سبعة أسابيع من العمر.
   1. الحفاظ على الفئران تحت شرط معين خالية من مسببات الأمراض.
   2. يسمح بفترة تأقلم بين ثلاثة إلى خمسة أيام بعد أن وصلت الفئران.
   3. في يوم التطعيم، يحلق في الجناح حيث سيتم الحقن (راجع الخطوة 2.3.6).
3. إعداد حقن خلية ورم
   ملاحظة: الاحتفاظ بتعليق خلية المصفوفة المثلج الغشاء العقيم طوال فترة الإجراءات.
   1. مزيج الخلايا ورسم بعناية بتعليق خلية في محقن 1 مل مزودة بإبرة ز 21.
   2. تحقق للتأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات الهواء في المحاقن.
   3. تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
   4. الضغط بلطف الجلد الماوس في الجناح بين الأصابع، في موقع الحقن.
   5. أدخل الإبرة بالضبط في حظيرة الجلد. لا تضع الإبرة عميقا في الأنسجة التأكد من حقن تحت الجلد.
   6. حقن 100 ميليلتر من تعليق خلية IMR5 (أي2.5 × 10⁶ خلايا) تحت الجلد في الجناح الأيسر السفلي من الفئران.
   7. تدوير حقنه لمنع التسرب وسحب الإبرة.
4. رصد التغيرات في وزن الجسم ونمو الورم
   1. قياس الطول (A) والعرض (ب) للورم مع قدمه ذات الورنيّة.
   2. حساب حجم الورم باستخدام الصيغة (أ س ب²) × 0.5.
   3. بدء العلاج عندما وصلت الأورام بحجم متوسط ~ 50-60 مم³.

3-المخدرات وإدارة الأجسام المضادة في الفئران

1. الإدارة عن طريق الحقن الوريدي في ماب 8B6
   1. ملء حقنه 1 مل مزودة بإبرة ز 25 مع الحل ماب بعناية.
   2. ضع الماوس تحت مصباح حرارة لمدة 10 دقيقة تمدد الوريد الذيل.
   3. كبح جماح الماوس في ريستراينير القوارض.
   4. تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
   5. أدخل الإبرة موازية الوريد الذيل، اختراق 2-4 ملم في التجويف مع الحفاظ على المجسم مشطوف الحواف إبرة الوجه الأعلى (الشكل 3A).
   6. حقن 100 ميليلتر من جسم الحل عن طريق الوريد (رابعا).
   7. عند الانتهاء من الحقن الضغط بلطف موقع الحقن منع النزيف.
2. داخل الإدارة من توبوتيكان
   1. رسم الحل المخدرات في حقنه 1 مل مزودة بإبرة 25 جرام.
   2. أمسك الماوس في موقف ضعيف، مع نهايته مؤخرة مرتفعة قليلاً.
   3. تطهير منطقة التطعيم للماوس مع حلاً مطهر.
   4. تحديد موقع البطن خط الوسط الماوس وعقلياً تقسيم البطن الأرباع. تحديد موقع الحقن في الربع العلوي الأيمن أو الأيسر (الشكل 3B).
   5. أدخل الإبرة في البطن (عمق 5 مم) في زاوية ~ 10°، في الربع العلوي الأيمن أو الأيسر.
   6. حقن 100 ميليلتر من حل المخدرات إينترابيريتونيلي (القائمة).
   7. تطهير الموقع التطعيم.

النتائج

الممثل النتائج والأرقام التي يتم تكييفها مع إذن من الأعمال المنشورة في وقت سابق¹⁴.

تآزر يعزز مكافحة OAcGD2 ماب 8B6 "الآثار المثبطة توبوتيكان نيوروبلاستوما الخلية خط" النمو:

لإنشاء المخدر?...

Discussion

للتنبؤ بتأثير التفاعلات المخدرات، يمكن استخدام ثلاثة أساليب: منهجية إيسوبولوجرام¹⁷و نموذج الخليط غير الخطية¹⁸والتركيبة فهرس¹. تحليل مؤشر تركيبة هو الأكثر استخداماً لأن تطبيقه هو تبسيط بتوافر برنامج كمبيوتر سهلة الاستعمال. لهذا الغرض، نحن أولاً تتسم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation kit (MTT)	Roche	11-465-007-001
CompuSyn software	ComboSyn		Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver	Bioseb	BIO-1556
Fetal calf serum	Eurobio	CVFSVFF00-01	10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox	Mozilla Corporation		Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp	Verre&Quartz	4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line	Accegen Biotechnology	ABC-TC0450	IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine	Gibco	25030-024	2 mM in RPMI 1640
Lysis solution	Roche	11-465-007-001
mAb 8B6	University of Nantes	N/A
Matrigel	Corning	354248
Multiskan FC	Thermofischer Scientific	N08625
Needle 21G 1 ½	BD Microlance	304432
Needle 25G 1	Terumo	NN-2525R
NSG mice	Charles River Laboratories	5557
Nunc MicroWell 96-well microplates	Thermofisher	167008
PBS	VWR	L182-10
PBS, 0,05% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
PC that runs windows 7	Microsoft		Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir	Thermofischer Scientific	8094
Rodent restrainer	Bioseb	TV-150-SM
RPMI 1640	Gibco	31870-025
Syringe 1 mL	Henke Sass Wolf	5010.200V0
Topotecan	Sigma-Aldrich	T2705