Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synergien zwischen einem Anti-Krebs-Antikörper und Zytostatika in präklinischen Modellen zu bewerten, indem Sie unter Verwendung der Kombination Index Gleichung von Chou und Talalay.

Zusammenfassung

Potenzierung der feindlichen monoklonaler Antikörper (mAb) durch Chemotherapeutika stellt eine sinnvolle Strategie für die Gestaltung effektiver und sicherer Therapie gegen Krebs. Hier bieten wir ein Protokoll, um eine vernünftige Kombination in der präklinischen Phase zu identifizieren. Zunächst beschreiben wir eine zellbasierte Assays um den Synergismus zwischen Anti-Krebs-mAb und Zytostatika, zu beurteilen, der die Kombination Index Gleichsetzung von Chou und Talalay¹verwendet. Dazu gehören die Messung des Tumor Zelle Droge - und Antikörper-Empfindlichkeit mit einem MTT-Assay, gefolgt von einer automatisierten Computeranalyse die Kombination Index (CI) Werte berechnen. CI-Werte der < 1 Synergismus zwischen getesteten mAbs und Zytostatika¹anzugeben. Um die in-vitro- Ergebnisse in Vivobestätigen, beschreiben wir weiter eine Methode zur Bestimmung der Kombination Therapie Wirksamkeit in einem Xenograft-Tumor-Modell. In diesem Modell verzögert die kombinierte Therapie deutlich Tumorwachstum, führt zu einer erweiterten signifikanten Überlebensvorteil im Vergleich zu Single-Agent-Steuerelemente. Wichtig ist, zeigt der in-Vivo -Experimente, dass die Kombinationstherapie gut vertragen wird. Dieses Protokoll ermöglicht die effektive Bewertung der Anti-Krebs-Medikamenten-Kombinationen in präklinischen Modellen und die Identifizierung von rationalen Kombination, in klinischen Studien zu bewerten.

Einleitung

Der konventionelle Ansatz bei der Behandlung einer großen Anzahl von verschiedenen Arten von Krebs beruhte auf Monotherapie. Auch wenn es noch in vielen Fällen verwendet wird, erfüllt diese Methode mehrere Hindernisse zu entscheiden sich für kombinierte Therapien². Insbesondere sind Krebszellen anfälliger für Widerstand, wenn ein einzelnes Medikament behandelt, durch Induktion alternative überleben Mechanismen³, was zu therapeutischen Scheitern in Patienten⁴zu entwickeln. Darüber hinaus werden in Monotherapie, Medikamente in der Regel in einer hohen Dosis verwaltet. Diese Situation oft führt das Auftreten von starken dosisabhängige Nebenwirkungen, die Ärzte die Behandlung²stoppen erzwingen und unerträglich werden können. Aus diesen Gründen ist der Verband der Anti-Krebs-Moleküle nun lieber Monotherapie.

Ideale Wirkstoffkombinationen wäre diejenigen, die in Synergie gegen Tumorzellen, ohne erhöhte Toxizität gegen normale Zellen handeln. Synergismus bezieht sich auf die Interaktion von zwei oder mehr Medikamenten, die eine therapeutische Wirkung mehr als die Summe jedes einzelne Medikament handeln separat produziert. Solche Interaktionen können erweiterte klinische therapeutische Wirksamkeit²führen. Es begrenzt Therapieresistenz, erhöht die Wirksamkeit und Toxizität²auch verringern kann. In der Tat kann die Dosierung der einzelnen Drogen reduziert werden, um ihre Nebenwirkungen zu senken, indem Sie auf verschiedenen Wegen. Darüber hinaus kann eines der Moleküle auch als eine sensibilisierende Mittel gegen Krebszellen dienen. Die Wirkung des zweiten Medikaments kann auf sensibilisierte Zellen verstärkt werden und weniger Dosierungen können gebrauchte⁵.

Kombinierte Therapie kann zwei oder mehrere Chemotherapeutika und/oder Biologics wie monoklonale Antikörper⁶enthalten. Diese mAbs gezielt Zellen mit dem Ausdruck einer Zelle Oberflächenantigen von Interesse und sind in der Lage, Tumorzellen durch immunologische Wege einschließlich Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC), töten unter Einbeziehung der immun Effektorzellen ⁷und Komplement-abhängige Zytotoxizität (CDC)⁶. Sie können auch über einen nicht-immunologischen Mechanismus vermittelt durch Apoptose^8,9,10,11agieren. In diesem Fall kann die Induktion des Prozesses des programmierten Zelltods Krebszellen zu sensibilisieren, Schwächen ihre Funktion und der damit verbundenen Chemotherapeutikum mit einer niedrigeren Dosierung effektiver zu gestalten. Als solche Proapoptotic mAb sind gute Kandidaten für die Gestaltung von Kombination Therapien mit Zytostatika.

Verschiedene mathematische Modelle sind beschrieben worden, um Droge Synergismus zu beurteilen; eine davon basiert auf der Kombination Index Methode¹. Diese Methode basiert auf dem Median-Wirkung-Prinzip von Chou¹entwickelt. Die Median-Effekt-Gleichung korreliert die Medikamentendosis und Drogenwirkung wie folgt.

Dabei ist D die Medikamentendosis; DM ist die Median-Effekt-Dosis; FA ist der Bruchteil der Dosis davon betroffen; m ist ein Exponent, die die Form der Dosis-Wirkungs-Plot-¹bedeutet. Die Median-Effekt-Dosis wird verwendet, um die Dosis Dx eines Medikaments zu berechnen, die hemmt oder tötet "X" Prozent der Zellen. Der CI-Wert errechnet dann um die additive Wirkung der Droge Kombination,¹folgendermaßen zu bewerten.

CI der Wert 1 gibt an, eine additive Wirkung und einem CI-Wert von < 1 zeigt einen synergistischen Effekt, während ein CI-Wert von > 1 zeigt Antagonismus¹. Die Anwendung dieser Methode wird weiter durch die Verfügbarkeit eines Computerprogramms, CompuSyn, die bestimmt Synergismus und Antagonismus bei allen Dosen erleichtert oder Effektstufen simulierte automatisch¹².

Unsere Gruppe entwickelt die mAb 8B6 speziell für O-Acetyl-GD2 Gangliosid (OAcGD2) Neuroblastom Antigen¹³ und weiter gezeigt, dass diese mAb Zelltod mit Attributen der Apoptose¹¹induzieren kann. Um zu testen ob mAb 8B6 Neuroblastom-Zellen, die antineoplastische Agenten Topotecan sensibilisieren können, haben wir die oben genannten Methode, entwickelt von Chou¹angepasst. Zunächst bestimmen wir die wirksame Dosis 50 (ED₅₀) Werte der mAb 8B6 und Topotecan. Als nächstes sind die Neuroblastom-Zellen mit zwar Verhältnisse der beiden Wirkstoffe basierend auf ED₅₀ Werte ausgesetzt, um die CI-Werte mit den oben genannten Simulations-Software zu ermitteln. Diese Methode ermöglicht uns, Synergien zwischen mAb 8B6 und Topotecan in Vitrozu demonstrieren. Wir beschreiben Sie anschließend ein Protokoll, um weiter die Wirksamkeit und die Sicherheit dieser Kombination Therapie in Vivozu beurteilen. Dieses Protokoll kann leicht angewendet werden, um starke und sichere Anti-Krebs-mAb und Chemotherapeutikum Kombinationen in präklinischen Studien auszuwählen. Eine schematische Darstellung dieser Studie ist in Abbildung 1zur Verfügung gestellt.

Protokoll

Tierhaltung und experimentelle Verfahren wurden von der französischen Regierung (Vereinbarungen #C44-278 und #APAFIS 03479.01) genehmigt. Tierbetreuung und Verfahren wurden unter Richtlinie EU 2010/63/EU und Französisch Gesetz #2013-118 zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere durchgeführt.

1. Bewertung der Droge Interaktion zwischen mAb 8B6 und Topotecan In Vitro

1. 96-Well-Probenvorbereitung
   Achtung: Wenden Sie sich an die Institution Arbeitsschutzausschuss und lokale Vorschriften Regeln im Zusammenhang mit Sicherheit im Labor. Überprüfen Sie die Material- und Sicherheitsdatenblatt Informationen vor der Arbeit mit Medien, Zell-Linien oder Reagenzien. Verwenden Sie korrekten sterilen Technik und arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube. Alle Lösungen/Geräte, die verwendet werden, um Zellen zu manipulieren müssen steril sein.
   Hinweis: Das folgende Protokoll wurde für die Verwendung mit adhärenten Zellen entwickelt. Änderungen sind erforderlich, um die Methode auf nonadherent Zellen in Suspension wachsen anzuwenden; Dieses Protokoll verwendet für jede Versuchsbedingung vervierfacht.
   1. Wachsen Sie IMR5 Zellen in einem T75 Kolben.
   2. Am ersten Tag (Tag 0) beobachten Sie die Zellkultur unter dem Mikroskop, die Zelle Konfluenz zu überprüfen. Aspirieren der Zelle Medium aus der Flasche, waschen Sie es mit 5 mL der Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), und 3 mL 0,05 % Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) / PBS-Lösung. Den Kolben in den Inkubator für 3 min (37 ° C, 5 % CO₂) zurück.
   3. Prüfen der Zellkultur unter dem Mikroskop für Zelle ablösen.
      Hinweis: Bei Bedarf zurück der Küvette in den Inkubator für eine zusätzliche 3 bis 5 min, je nach Zelltyp Tumor.
   4. Die Flasche 10 mL Medium vollständige Zelle hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine sterile 15 mL konische Rohr. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min bei 300 X g. Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer.
   5. Entfernen und entsorgen des Überstands. Die Zelle Pellet in komplette Wachstumsmedium aufzuwirbeln. Die mittlere Lautstärke um eine Endkonzentration von 1 x 10⁵ Zellen/mL zu erhalten.
   6. Samen 84 Brunnen einer 96-Well-Kultur-Platte mit 10⁴ Zellen jeweils 100 µL Zellsuspension ist. Folgen Sie der experimentellen Layout in Abbildung 2dargestellt.
   7. Inkubieren Sie die Zellen für 18 h in der Zelle-Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂).
2. Vorbereitung der Droge-Lösung
   Hinweis: Für Drogen/mAb Sensibilisierung Studien, ändern Sie das Timing, die Länge und die Konzentration Behandlung entsprechend der bestimmten Medikament/mAb in Frage. Beachten Sie, dass die Ausgangskonzentration 3 x die Endkonzentration.
   1. Bereiten Sie am nächsten Morgen (Tag 1), die folgenden Medikament Lösungen mit vollständigen Wachstumsmedium.
      1. Vorbereitung der mAb-Lösung
         1. Verdünnen Sie mAb in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Antikörper funktionierende Lösung mit einer Konzentration von mAb von 240 µg/mL zu erhalten.
         2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
      2. Vorbereitung der Topotecan-Lösung
         1. Verdünnte, als über das Medikament in 500 µL des vollständigen Wachstumsmedium zu einem Medikament funktionierende Lösung mit einer Endkonzentration von 120 nM.
         2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
      3. Antikörper und Drogen Vorbereitung der Lösung
         1. Verdünnen Sie die Droge und mAb Lösungen in 500 µL kompletten Wachstumsmedium, eine Lösung auf 120 nM Drogen- und 240 µg/mL mAb (Arbeitslösung) zu erhalten.
         2. Führen Sie fünf zweifache Verdünnungsreihen, wie in Abbildung 2gezeigt.
   2. Um die Endkonzentration ankommen, übertragen Sie 50 µL jeder Medikamentenlösung in die entsprechenden Vertiefungen, wie angegeben im experimentellen Layout ( Abbildung 2).
      Hinweis: Übertragen Sie 50 µL kompletten Wachstumsmedium in den unbehandelten Zellen Vertiefungen, wie in Abbildung 2gezeigt.
   3. Inkubieren Sie die Zellen für 72 h im Inkubator (37 ° C, 5 % CO₂).
3. MTT-assay
   1. Fügen Sie 10 µL MTT Reagenzlösung in jede Vertiefung.
   2. Inkubation bei 37 ° C für 4 h.
   3. 100 µL der Lyse-Lösung (10 % SDS in 0,01 M HCl) in jede Vertiefung mit einer Mehrkanal-Pipette, und gründlich mischen durch pipettieren.
   4. Inkubation bei 37 ° C für 4 h in eine feuchte Kammer (95 % Feuchtigkeit).
   5. Lesen Sie die Extinktion bei 570 nm (eine₅₇₀) und 620 nm (ein₆₂₀) mit einem Spektralphotometer.
      Hinweis: Mischen Sie jede Probe wieder durch Pipettieren vor dem Lesen der Extinktion; Extinktion bei 620 nm ermöglicht die Korrektur von unspezifischen Hintergrund Werten.
   6. Berechnen Sie die korrigierte Extinktion: korrigierte Extinktion = eine₅₇₀- ein₆₂₀.
   7. Die Zellviabilität wie folgt zu berechnen: Zelle überleben = 100 X (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).
   8. Der Bruchteil betroffen Werte (Fa) unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnen: 1 - (probieren Sie mittlere korrigierte Extinktion / mittlere korrigierte Extinktion zu kontrollieren).
4. Droge Interaktion analytische Simulationssoftware für Single und Kombination Medikamentenstudien
   1. Starten Sie die Simulationssoftware um das Startfenster zu öffnen.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Neues Experiment , das Main -Fenster zu öffnen.
   3. Geben Sie den Namen des Experiments im Fenster " Namen ".
      Hinweis: Im Fenster " Datum " kann ein Datum hinzugefügt werden.
   4. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue einziges Medikament ".
   5. Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".
   6. Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .
   7. Geben Sie das Medikament Konzentration Gerät im Fenster " Einheiten ".
   8. Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis und Fa Wert, drücken Sie die Eingabetaste.
   9. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.
   10. Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ".
   11. Die gleichen Schritte zum mAb-Daten-Punkte eingeben.
       Hinweis: Verwenden Sie die gleiche Konzentration Einheit wie durch Medikament verwendet wird.
   12. Klicken Sie auf die Schaltfläche " Neue Droge-Combo ".
   13. Wählen Sie Droge und mAb.
   14. Wählen Sie Konstantes Verhältnis , und klicken Sie auf "OK".
   15. Geben Sie den Namen im Fenster " Vollständiger Name ".
   16. Geben Sie das Kürzel im Fenster Abbrev .
   17. Geben Sie das Medikament/mAb-Verhältnis im Verhältnis der Fenster.
   18. Geben Sie Daten Punkt 1 Dosis ein und drücken Sie die Eingabetaste.
       Hinweis: Das Programm berechnet automatisch die Dosen von mAb und Combo.
   19. Geben Sie die Daten Punkt 1 Fa -Wert, und drücken Sie die Eingabetaste.
   20. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis alle Datenpunkte eingetragen sind.
   21. Klicken Sie auf die Schaltfläche " fertig ", und klicken Sie dann auf die Schaltfläche " Bericht erstellen ".
   22. Wählen Sie Medikament und mAb aus, und klicken Sie auf "OK".
   23. Wählen Sie Combo , und klicken Sie dann auf OK.
   24. Header, CI-Tabelleund zusammenfassende Tabelleauswählen. Klicken Sie auf "OK".
   25. Geben Sie den Dateinamen des Analyse-Datei und klicken Sie auf Speichern , um den Bericht zu generieren.
       Hinweis: Nach einem Klick auf "OK", wird der Bericht im Standard-Webbrowser des Computers automatisch geöffnet.
   26. Um den Bericht zu drucken, wählen Sie Drucken aus dem Web-Browser-Menü "Datei". Der Bericht enthält eine Zusammenfassung Tabellenabschnitt, die Titel, Datum, Dateiname, Beschreibung Hinweis, Parameter ("m", "Dm" und "R"), ED₅₀ für entweder Agent verwendet in Monotherapie oder in Kombination und der CI-Tabelle für jede Kombination bei ED₅₀, ED _{enthält 75}, ED₉₀und ED₉₅.
       Hinweis: Ein CI-Wert von < 1 zeigt Synergismus, CI Wert = 1 bedeutet Additivität und einem CI-Wert von > 1 bedeutet Antagonismus.

2. Generation des menschlichen Neuroblastoma Xenotransplantate in Nonobese diabetische NOD Scid Gamma Mäuse (NSG Mäuse)

Anmerkung: Ohne jegliche Verunreinigung der Zellkultur. Da die Basalmembran Matrix eine Gel über 5 ° C bildet, sollten alle Cultureware oder Medien kommen in Kontakt mit der Basalmembran Matrix Reagenz prechilled/Eis-kalt sein. Halten Sie die Basalmembran Matrix auf dem Eis während des gesamten Prozesses.

1. Vorbereitung der Zellsuspension IMR5
   1. Tauen Sie die Basalmembran Matrix Reagenz über Nacht durch Eintauchen der Durchstechflasche im Eis im Kühlschrank 4 ° C vor dem Gebrauch auf.
   2. Am Tag 0 ernten Sie die kultivierten IMR5 Zellen wie oben.
   3. Übertragen Sie die Zellen auf eine 15 mL konische Rohr und Zentrifuge bei 300 X g für 5 min.
   4. Verwerfen Sie den überstand. Waschen Sie die Zellen 2 X mit 15 mL eiskaltem PBS und bereiten eine Zellsuspension von 5 x 10⁷ Zellen/mL in eiskaltem PBS.
      Hinweis: Bei Bedarf übertragen Sie die Zellsuspension zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
   5. Schwenken Sie die Basalmembran Matrix Durchstechflasche.
      Hinweis: Die Basalmembran Matrix Reagenz sollte aufgetaut und zerstreut werden.
   6. 1 Volumenteil Basalmembran Matrix Reagenz und mischen Sie es durch Pipettieren um eine Zellsuspension von 2,5 x 10⁷ Zellen /mL zu erhalten.
   7. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
2. Vorbereitung der Mäuse
   Hinweis: Die Mäuse sollte sechs bis sieben Wochen alt sein.
   1. Pflegen Sie Mäuse unter einer bestimmten Bedingung Pathogen-freies.
   2. Lassen Sie ein drei bis fünf Tagen Eingewöhnungszeit, nachdem die Mäuse angekommen sind.
   3. Am Tag der Impfung, rasieren die Flanke, wo werden die Injektion (siehe Punkt 2.3.6).
3. Vorbereitung der Tumor Zelle Injektion
   Hinweis: Halten Sie die eiskalte Basalmembran Matrix Zellsuspension aseptischen während des Verfahrens.
   1. Mischen Sie die Zellen und ziehen Sie vorsichtig die Zellsuspension in eine 1 mL Spritze mit einer Nadel 21 G montiert.
   2. Vergewissern Sie sich, dass keine Luftblasen in der Spritze befinden.
   3. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
   4. Drücken Sie vorsichtig die Maus Haut an der Flanke zwischen den Fingern, an der Injektionsstelle.
   5. Stechen Sie die Nadel genau in die Hautfalte. Stellen Sie die Nadel nicht tief in das Gewebe um eine subkutane Injektion zu gewährleisten.
   6. Injizieren Sie 100 µL Zellsuspension IMR5 (d.h., 2,5 x 10⁶ -Zellen) in der unteren rechten Flanke der Mäuse subkutan.
   7. Drehen Sie die Spritze um auslaufen zu verhindern und ziehen Sie die Nadel heraus.
4. Überwachung von Gewichtsveränderungen und Tumorwachstum
   1. Messen Sie die Länge (A) und die Breite (B) des Tumors mit einer Zange.
   2. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit Hilfe der Formel (A x B²) x 0,5.
   3. Therapie zu beginnen, wenn die Tumoren ein durchschnittliches Volumen von ~ 50-60 mm³erreicht haben.

3. Drogen und Antikörper-Verwaltung bei Mäusen

1. Die intravenöse Gabe von mAb 8B6
   1. Füllen Sie vorsichtig eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel mit mAb Lösung montiert.
   2. Platzieren Sie den Mauszeiger unter einer Wärmelampe für 10 min, die Rute Vene zu dehnen.
   3. Die Maus in einem Nagetier Restrainer zurückhalten.
   4. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
   5. Stechen Sie die Nadel parallel zur Rute Vene, durchdringenden 2-4 mm in das Lumen unter Beibehaltung der Schräge der Nadel Gesicht nach oben (Abb. 3A).
   6. 100 µL Antikörper-Lösung intravenös zu injizieren (i.v.).
   7. Nach Beendigung die Injektion sanft Druck der Injektionsstelle Blutungen zu verhindern.
2. Intraperitoneale Gabe von topotecan
   1. Zeichnen Sie die Wirkstofflösung in eine 1 mL Spritze mit einer 25 G Nadel montiert.
   2. Halten Sie die Maus in Rückenlage, mit seinem hinteren Ende leicht erhöht.
   3. Desinfizieren Sie die Impfung Bereich der Maus mit einer antiseptischen Lösung.
   4. Suchen Sie die Maus Bauch Mittellinie und geistig teilen Sie sich den Bauch in Quadranten. Suchen Sie die Injektionsstelle im rechten oder linken unteren Quadranten (Abb. 3 b).
   5. Stechen Sie die Nadel in die Bauchhöhle (5 mm tief) in ~ 10°-Winkel, im rechten oder linken unteren Quadranten.
   6. 100 µL Medikamentenlösung intraperitoneale Injektion (i.p.).
   7. Desinfizieren Sie die Impfung-Website.

Ergebnisse

Die repräsentative Ergebnisse und Zahlen werden mit freundlicher Genehmigung von früher veröffentlichten Arbeit¹⁴angepasst.

Anti-OAcGD2 mAb 8B6 fördert synergistisch hemmende Effekte von Topotecan auf Neuroblastom Zellwachstum Linie:

Herstellen der Droge und die Antikörper-Konzentrationen verwendet werden, für die Beurteil...

Diskussion

Um die Auswirkungen von Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten vorherzusagen, drei Methoden können verwendet werden: die Isobologram Methodik¹⁷, nichtlineare Mischung Modell¹⁸und die Kombination index¹. Indexanalyse Kombination wird am häufigsten verwendet, da seine Anwendung durch die Verfügbarkeit eines benutzerfreundlichen Computerprogramms vereinfacht wird. Zu diesem Zweck gekennzeichnet wir zuerst die Dosis-Wirkungs-Antwort von jeder Agent...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation kit (MTT)	Roche	11-465-007-001
CompuSyn software	ComboSyn		Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver	Bioseb	BIO-1556
Fetal calf serum	Eurobio	CVFSVFF00-01	10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox	Mozilla Corporation		Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp	Verre&Quartz	4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line	Accegen Biotechnology	ABC-TC0450	IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine	Gibco	25030-024	2 mM in RPMI 1640
Lysis solution	Roche	11-465-007-001
mAb 8B6	University of Nantes	N/A
Matrigel	Corning	354248
Multiskan FC	Thermofischer Scientific	N08625
Needle 21G 1 ½	BD Microlance	304432
Needle 25G 1	Terumo	NN-2525R
NSG mice	Charles River Laboratories	5557
Nunc MicroWell 96-well microplates	Thermofisher	167008
PBS	VWR	L182-10
PBS, 0,05% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
PC that runs windows 7	Microsoft		Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir	Thermofischer Scientific	8094
Rodent restrainer	Bioseb	TV-150-SM
RPMI 1640	Gibco	31870-025
Syringe 1 mL	Henke Sass Wolf	5010.200V0
Topotecan	Sigma-Aldrich	T2705