抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的潜力: 用组合指数方程检测抗体-药物协同作用

摘要

该方案介绍了如何利用周药和塔拉莱的组合指数方程来评价临床前模型中抗癌抗体与抗肿瘤药物之间的协同作用。

摘要

化疗药物对敌对单克隆抗体 (mab) 的潜在作用是设计有效、更安全的癌症治疗方法的一个有价值的策略。在这里, 我们提供了一个协议, 以确定一个合理的组合在临床前的步骤。首先, 我们描述了一种基于细胞的检测方法, 利用周和塔拉莱1的组合指数方程来评价抗癌 mab 与细胞毒性药物之间的协同作用.这包括使用 mtt 检测肿瘤细胞药物和抗体敏感性, 然后进行自动计算机分析, 以计算组合指数 (ci) 值。ci 值和 lt;1 表明 mabs 与细胞毒性剂1之间的协同作用^.为了证实体内的体外发现, 我们进一步描述了一种方法来评估在异种移植肿瘤模型中的组合方案的有效性。在这种模型中, 联合方案显著延缓了肿瘤的生长, 与单剂对照相比, 这将显著延长生存期。重要的是,体内实验表明, 组合方案是耐受性良好。该方案允许在临床前模型中有效评估抗癌药物组合, 并确定合理的组合, 以便在临床试验中进行评估。

引言

治疗大量不同类型癌症的常规方法是以单一疗法为基础的。即使它仍然在许多情况下使用, 这种方法遇到了几个障碍, 导致选择综合疗法²。特别是, 癌细胞在用单一药物治疗时更容易产生耐药性, 通过诱导替代生存机制³, 导致4例患者^的治疗失败。此外, 在单一疗法中, 药物通常是在高剂量的。这种情况往往会导致强烈的剂量依赖性副作用的发生, 这可能是不能容忍的, 并迫使医生停止治疗²。由于这些原因, 抗癌分子的关联现在是首选的单一疗法。

理想的药物组合将是那些对肿瘤细胞协同作用的药物组合, 而不会增加对正常细胞的毒性。协同作用是指两种或两种以上药物的相互作用, 它们产生的治疗效果大于每种药物单独作用的总和。这种相互作用可能会提高临床治疗效果²。它限制了治疗的抵抗力, 提高了疗效, 也可以减少毒性²。事实上, 每种药物的剂量都可以通过针对不同的途径来降低副作用。此外, 其中一种分子还可以作为对抗癌细胞的增敏剂。第二种药物对致敏细胞的作用可以增强, 使用剂量较少, 可使用 5.

综合治疗可包括两种或两种以上的化疗药物和/或生物制剂, 如单克隆抗体⁶。这些 mabs 专门针对表达感兴趣的细胞表面抗原的细胞, 能够通过免疫途径杀死肿瘤细胞, 包括抗体依赖细胞介导的细胞毒性 (adcc), 并参与免疫效应细胞的作用⁷、和互补相关的细胞毒性 (cdc)⁶。它们还可以通过细胞凋亡^{8、9、10、11}介导的非免疫机制发挥作用。在这种情况下, 诱导程序性细胞死亡过程可能会敏感癌细胞, 削弱其功能, 并使相关的化疗药物更有效, 在较低的剂量。因此, 原凋亡 mab 是设计抗肿瘤药物组合方案的理想选择。

不同的数学模型被描述了评估药物协同作用;其中之一是基于组合索引方法¹。该方法以周一开发的中效应原理为基础.中效应方程将药物剂量与药物效应相关联, 如下所示。

在这里, d是药物剂量;dm是中效应剂量;法是受剂量影响的分数;m是表示剂量效应图1形状的指数^.中效应剂量用于计算抑制或杀死 "x"% 细胞的药物的剂量dx .然后计算 ci 值, 以评估药物组合的加性效应, 如下所示。

ci 值为1表示加性效应, ci 值表示 lt;1 表示协同作用, 而 ci 值表示 gt;1 表示拮抗 1.计算机程序 "compusyn" 的可用性进一步促进了这种方法的应用, 该程序在自动模拟的所有剂量或效果水平^下确定协同作用和拮抗作用。

本组开发了 o-乙酰-gd2 神经母细胞苷 (oacgd2) 神经母细胞^{瘤抗原 13}的 mab 8b6 特异性 mab 8b6, 并进一步证明, 这种 mab 能够诱导细胞死亡, 具有凋亡的属性¹¹。为了测试 mab 8b6 是否能对抗肿瘤药物 topotecan 敏感, 我们采用了周1开发的上述方法.首先, 我们确定了 mab 8b6 和 topotecan 的有效剂量 50 (ed₅₀)。接下来, 利用上述模拟软件, 暴露基于 ed₅₀值的两种化合物的等能比神经母细胞瘤细胞, 以确定 ci 值。这种方法使我们能够在体外证明 mab 8b6 和 topotecan 之间的协同作用。接下来, 我们描述一个协议, 以进一步评估这种组合方案在体内的效力和安全性。该方案可方便地应用于临床前研究中有效、安全的抗癌 mab 和化疗药物组合的选择。图 1提供了这项研究的示意图。

研究方案

法国政府批准了动物住房和实验程序 (#C44 278号和 #APAFIS 03479.01 的协定)。根据欧盟 201/63/欧盟和法国 #2013----118号关于保护用于科学目的的动物的法律----进行了动物照料和程序。

1. mab 8b6 与 topotecan 体外药物相互作用的评价

1. 96孔样品制备
   注意: 请咨询机构的健康和安全委员会, 并遵守与实验室安全相关的当地法规规则。在使用任何介质、细胞系或试剂之前, 请查看材料和安全数据表信息。使用适当的无菌技术, 并在层流罩中工作。所有用于操作细胞的溶液/设备必须是无菌的。
   注: 以下协议是为与粘附细胞一起使用而设计的。需要修改该方法, 将其应用于悬浮液中生长的非粘附细胞;该协议对每个实验条件使用四年式。
   1. 在 t75 瓶中长出 imr5 单元格。
   2. 第一天 (第0天), 在显微镜下观察细胞培养情况, 检查细胞融合情况。从烧瓶中吸泡细胞培养基, 用5毫升磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗, 加入3毫升的0.05% 乙二胺四乙酸 (edta)/pbs 溶液。将烧瓶送回孵化器 3分钟 (37°c, 5% co₂)。
   3. 在显微镜下检查细胞培养是否有细胞分离。
      注: 如有必要, 根据肿瘤细胞类型, 将烧瓶返回孵化器3至5分钟。
   4. 在烧瓶中加入10毫升完整的细胞培养基, 并将细胞悬浮液转移到无菌的15毫升锥形管中。在 300 x g处离心细胞5分钟。用血细胞仪计数细胞。
   5. 取下并丢弃上清液。在完全生长介质中重新使用细胞颗粒。调整介质体积以获得 1 x^{10 5}细胞的最终浓度。
   6. 一个96孔培养板的种子84口, 每个^培养板有 10个4个细胞, 即100μl 的细胞悬浮液。按照图 2所示的实验布局进行操作。
   7. 在细胞孵化器中孵育细胞 18小时 (37°c, 5% co₂)。
2. 药物溶液制备
   注: 对于药物/mab 敏化研究, 修改时间、长度和浓度处理, 以适应所涉特定药物。请注意, 初始浓度为最终浓度的3倍。
   1. 第二天早上 (第1天), 使用完整的生长介质准备以下药物溶液。
      1. mab 溶液制备
         1. 在500μl 的完全生长培养基中稀释 mab, 得到 mab 浓度为 240μg/ml 的抗体工作溶液。
         2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
      2. 托普托坦解决方案的准备
         1. 稀释, 如上所示, 药物在500μl 的完整生长介质中获得最终浓度为 120 nm 的药物工作溶液。
         2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
      3. 抗体和药物溶液的制备
         1. 在500μl 的完整培养基中稀释药物和 mab 溶液, 以获得 120 nm 药物和 240μml mab (工作溶液) 的溶液。
         2. 执行五个两倍串行稀释, 如图 2所示。
   2. 如实验布局所示 (图 2), 要达到最终浓度, 请将每个药物溶液的50μl 转移到相应的井中。
      注: 将50μl 的完整培养基转移到未经处理的细胞井中, 如图 2所示。
   3. 在孵化器中孵育细胞 72小时 (37°c, 5% co₂)。
3. mtt 检测
   1. 在每口井中加入10μl 的 mtt 试剂溶液。
   2. 在37°c 下孵化4小时。
   3. 使用多通道移液器, 在每口井中加入100μl 裂解溶液 (0.01 m hcl 中的 10% sds), 并通过移液进行彻底混合。
   4. 在37°c 下, 在加湿室内 (95% 的湿度) 中孵化4小时。
   5. 使用分光光度计读取 570 nm (_{a 570}) 和 620 nm (a₆₂₀) 的吸收率。
      注: 在阅读吸收率之前, 通过移液将每个样品再次混合;在620纳米的吸收允许修正非特异性背景值。
   6. 计算校正后的吸收率: 校正吸收率 =_{a 570-a620}。
   7. 计算细胞活力如下: 细胞活力 = 100 x (样品平均修正吸收/控制均值修正吸收率)。
   8. 使用以下公式计算分数影响值 (法): 1-(样品均值校正吸收率/控制均值校正吸收率)。
4. 药物交互分析模拟软件, 用于单药组合研究
   1. 运行模拟软件以打开启动窗口。
   2. 单击 "新建实验" 按钮以打开主窗口。
   3. 在 "名称"窗口中键入实验的名称。
      注: 可以在 "日期"窗口中添加日期。
   4. 点击新的单一药物按钮。
   5. 在 "全名" 窗口中键入名称。
   6. 在abbrev窗口中键入缩写。
   7. 在 "单位"窗口中键入药物浓度单位。
   8. 输入数据点1的剂量和法值, 按enter。
   9. 重复此步骤, 直到输入所有数据点。
   10. 点击"完成"按钮。
   11. 按照相同的步骤输入 mab 数据点。
       注: 使用与药物相同的浓度单位。
   12. 点击新药物组合按钮。
   13. 选择 "药物和mab"。
   14. 选择"恒定比率", 然后单击"确定"。
   15. 在 "全名" 窗口中键入名称。
   16. 在abbrev窗口中键入缩写。
   17. 在窗口比率中键入药物/mab 比率 。
   18. 输入数据点1剂量, 然后按enter。
       注: 程序将自动计算 mab 和组合的剂量。
   19. 输入数据点1法的值, 然后按enter。
   20. 重复此步骤, 直到输入所有数据点。
   21. 单击 "已完成"按钮, 然后单击 "生成报告" 按钮。
   22. 选择药物和 mab, 然后单击 "确定"。
   23. 选择"组合" , 然后单击 "确定"。
   24. 选择 "标题"、 "ci" 表和"摘要表"。然后, 单击 "确定"。
   25. 键入分析文件的文件名, 然后单击 "保存"生成报告。
       注: 单击"确定"后, 报表将在计算机的默认 web 浏览器中自动打开。
   26. 要打印报表, 请从 web 浏览器的文件菜单中选择"打印" 。该报告包含 "摘要表" 部分, 其中包括标题、日期、文件名、描述说明、参数 (m、dm 和 r)、单药或组合中使用的代理_{的 ed 50} , 以及 ed 50、ed_{的每个组合的 ci 表75}、ed₉₀和_{ed 95}。
       注: lt;1 的 ci 值表示协同作用, ci 值 = 1 表示加性, ci 值 & gt;1 表示拮抗。

2. 非肥胖糖尿病诺德伽玛小鼠 (nsg 小鼠) 中人神经母细胞瘤异种移植物的产生

注: 排除细胞培养的任何污染。由于基底膜基质在5°c 以上形成凝胶, 所有与基底膜基质试剂接触的培养材料或介质都应预先冰凉。在整个过程中, 将基底膜基质保持在冰上。

1. imr5 细胞悬浮液的制备
   1. 使用前, 将小瓶浸入冰中, 将基底膜基质试剂浸入冰中, 一夜之间解冻。
   2. 在第0天, 采集上述详细的培养的 imr5 细胞。
   3. 将细胞以 300 x g 的速度转移到15毫升的锥形管和离心机中5分钟。
   4. 放弃上清液。用15毫升的冰凉 pbs 清洗细胞 2x, 并在冰寒 pbs 中制备 5 x^{10 7 细胞}的细胞悬浮液。
      注: 如有必要, 将细胞悬浮液转移到 1.5 ml 微离心管中。
   5. 旋转基底膜基质小瓶。
      注: 基底膜基质试剂应解冻并分散。
   6. 加入一体积基底膜基质试剂, 通过移液混合, 得到 2.5 x^{10 7 细胞}的细胞悬浮液。
   7. 把细胞悬浮物放在冰上。
2. 小鼠的制备
   注: 老鼠应该是六到七个星期的年龄。
   1. 维持小鼠在特定的无病原体条件下。
   2. 在老鼠到达后, 允许3-5天的适应期。
   3. 接种当天, 刮掉将进行注射的侧翼 (见步骤 2.3.6)。
3. 肿瘤细胞注射的制备
   注: 在整个过程中保持冰凉基底膜基质细胞悬浮液无菌。
   1. 将细胞混合, 小心地将细胞悬浮液放入装有 21 g 针的1毫升注射器中。
   2. 检查以确保注射器中没有气泡。
   3. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
   4. 轻轻挤压鼠标的皮肤在手指之间的侧面, 在注射部位。
   5. 将针头完全插入皮肤褶皱中。不要将针头深入组织中, 以确保皮下注射。
   6. 皮下注射100μl 的 imr5 细胞悬浮液 (即2.5 x 10⁶细胞) 进入小鼠的右下侧。
   7. 旋转注射器以防止泄漏并取出针头。
4. 体重变化和肿瘤生长的监测
   1. 用卡尺测量肿瘤的长度 (a) 和宽度 (b)。
   2. 使用公式 (a x^b2) x 0.5 计算肿瘤体积。
   3. 当肿瘤的平均体积达到 ~ 50-60 毫米³时开始治疗。

3. 小鼠的药物和抗体管理

1. 静脉给药 mab 8b6
   1. 小心地填充装有 25 g 针的1毫升注射器, 并使用 mL 溶液。
   2. 将鼠标放在热灯下 10分钟, 以扩张尾静脉。
   3. 在防鼠器中约束老鼠。
   4. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
   5. 插入与尾静脉平行的针, 将2-4 毫米穿透腔, 同时保持针脸的斜面向上 (图 3 a)。
   6. 静脉注射100μl 抗体溶液 (即)。
   7. 注射完成后, 轻轻按压注射部位, 以防止出血。
2. 腹腔内给药托多替康
   1. 在装有 25 g 针的1毫升注射器中绘制药物溶液。
   2. 将鼠标保持在仰卧位, 其后端稍高。
   3. 用防腐剂消毒小鼠的接种区域。
   4. 找到老鼠的腹部中线, 精神上将腹部分成象限。找到右侧或左侧下象限的注射部位 (图 3b)。
   5. 将针头插入腹部 (5 毫米深), 角度约为 10°, 位于右或左下象限。
   6. 在腹腔内注入100μl 的药物溶液 (即)。
   7. 对接种部位进行消毒。

结果

代表性结果和数字根据允许适应从更加早期出版的工作¹⁴。

抗 oggd2 mab 8b6 协同增强托普替康对神经母细胞瘤细胞系生长的抑制作用:

为了建立用于评估 topotecan 和 mab 8b6 之间协同作用的药物和抗体浓度, 首先用 mAb 法测定了人 imr5 神经母细胞瘤细胞的药?...

讨论

为了预测药物相互作用的影响, 可以采用三种方法: 等深线图^{方法 17}、非线性混合模型¹⁸和组合指数¹。组合索引分析是最常用的, 因为它的应用通过用户友好的计算机程序的可用性得到了简化。为此, 我们首先通过执行 mtt 检测19来描述单独或联合使用的每个制剂的剂量效应反应^.这种方法依赖于活细胞的能力, 以减少四氮盐在紫?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation kit (MTT)	Roche	11-465-007-001
CompuSyn software	ComboSyn		Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver	Bioseb	BIO-1556
Fetal calf serum	Eurobio	CVFSVFF00-01	10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox	Mozilla Corporation		Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp	Verre&Quartz	4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line	Accegen Biotechnology	ABC-TC0450	IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine	Gibco	25030-024	2 mM in RPMI 1640
Lysis solution	Roche	11-465-007-001
mAb 8B6	University of Nantes	N/A
Matrigel	Corning	354248
Multiskan FC	Thermofischer Scientific	N08625
Needle 21G 1 ½	BD Microlance	304432
Needle 25G 1	Terumo	NN-2525R
NSG mice	Charles River Laboratories	5557
Nunc MicroWell 96-well microplates	Thermofisher	167008
PBS	VWR	L182-10
PBS, 0,05% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
PC that runs windows 7	Microsoft		Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir	Thermofischer Scientific	8094
Rodent restrainer	Bioseb	TV-150-SM
RPMI 1640	Gibco	31870-025
Syringe 1 mL	Henke Sass Wolf	5010.200V0
Topotecan	Sigma-Aldrich	T2705