Potentiation של נוגדנים נגד סרטן יעילות על-ידי סמים Antineoplastic: זיהוי של נוגדן תרופתיים הסינרגטיות באמצעות המשוואה אינדקס שילוב

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך הסינרגטיות בין נוגדן נגד סרטן תרופות antineoplastic במודלים פרה באמצעות המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay.

Abstract

Potentiation נוגדנים חד-שבטיים עוינת (mAb) על ידי סוכנים כימותרפיות מהווה אסטרטגיה רב ערך עבור תכנון טיפול יעיל ובטוח מפני סרטן. כאן אנו מספקים פרוטוקול כדי לזהות שילוב רציונלי בשלב פרה. ראשית, אנו מתארים הנועד מבוססת תא להעריך את הסינרגטיות בין mAb נגד סרטן תרופות ציטוטוקסיות, המשתמשת המשוואה אינדקס שילוב של צ'או, Talalay¹. זה כולל את המדידה של גידול התא סמים, נוגדן-רגישות שימוש assay MTT, ואחריו ניתוח המחשב אוטומטית כדי לחשב את ערכי אינדקס (CI) שילוב. CI ערכים של < 1 לציין הסינרגטיות בין mAbs נבדק סוכנים ציטוטוקסיות¹. כדי לאמת את במבחנה ממצאים ויוו, נתאר בהמשך שיטה כדי להעריך את היעילות של משטר השילוב במודל גידול xenograft. במודל זה, הטיפול המשולב מעכבת באופן משמעותי הגידול, כשהתוצאה הישרדות המורחבת משמעותית בהשוואה פקדים סוכן יחיד. חשוב, הניסויים ויוו חושף משטר השילוב הוא נסבל היטב. פרוטוקול זה מאפשר הערכת יעילות תרופה נגד סרטן צירופי במודלים פרה וזיהוי של שילוב רציונלי כדי להעריך בניסויים קליניים.

Introduction

הגישה הקונבנציונלית בטיפול של מספר רב של סוגים שונים של סרטן היה מבוסס על יחידני. אפילו אם זה משמש עדיין במקרים רבים, שיטה זו נפגשו מספר מכשולים שמוביל בחירה של טיפולים משולבים². במיוחד, תאים סרטניים פגיעים יותר לפתח עמידות כאשר מטופלים עם תרופה אחת על ידי גרימת הישרדות חלופי מנגנונים³, והתוצאה היא כישלון טיפולי בחולים⁴. יתר על כן, ביחידני, תרופות בדרך כלל הפארקים אחראית הרשות במינון גבוה. את המצב הזה לעיתים קרובות תוצאות המופע של תופעות לוואי למינון חזק זה יכול להיות בלתי נסבל, כוח רופאים להפסיק את הטיפול². מסיבות אלו, האגודה של מולקולות נגד סרטן הוא עכשיו העדיפו יחידני.

שילובים תרופתיים האידיאלי יהיה אלה שפועלים בסינרגיה נגד תאים סרטניים, ללא רעילות מוגברת נגד תאים נורמליים. הסינרגטיות מתייחס האינטראקציה של שניים או יותר תרופות שמייצר השפעה תרפויטית עולה על הסכום של כל תרופה בודדים מתנהג בנפרד. אינטראקציות כזה עלול לגרום משופרת יעילות טיפולית קלינית². זה מגביל את ההתנגדות הטיפול מגביר את היעילות, ניתן גם להפחית רעילות². למעשה, ניתן להפחית את המינון של כל תרופה כדי להפחית את תופעות הלוואי שלהן על ידי מיקוד מסלולים שונים. בנוסף, אחד של המולקולות יכול לשמש גם סוכן sensitizing נגד תאים סרטניים. ההשפעה של התרופה השנייה שעשויים להיות מוגברת על תאים sensitized, המינונים פחות יכול להיות בשימוש⁵.

טיפול משולב יכול לכלול שניים או יותר תרופות כימותרפיות ו/או תרופות/מוצרים ביולוגיים, כגון נוגדנים חד-שבטיים⁶. אלה mAbs במיוחד היעד תאים המבטאים אנטיגן פני שטח התא של עניין מסוגלות להרוג תאים סרטניים באמצעות מסלולים אימונולוגי כולל נוגדנים תלויי תאית cytotoxicity (ADCC), עם המעורבות של תאים חיסוניים אפקטור ⁷, cytotoxicity תלויי-המשלים (CDC)⁶. הם גם משמשים דרך מנגנון חיסוניות מתווכת על ידי אפופטוזיס^8,9,10,11. במקרה זה, אינדוקציה של התהליך של מוות תאים מתוכנת עלול לרגש תאים סרטניים, להחליש את תפקידם ולבצע את כימותרפית המשויך יעיל יותר במינון נמוך יותר. ככזה, proapoptotic mAb הם מועמדים טובים עבור עיצוב משטרי בשילוב עם תרופות antineoplastic.

מודלים מתמטיים שונים תוארו להעריך הסינרגטיות סמים; אחד מהם הוא מבוסס על שילוב מדד בשיטה¹. שיטה זו מבוססת על העיקרון חציון-אפקט שפותחה על ידי צ'או¹. המשוואה חציון-אפקט מופיע את מינון התרופה לבין האפקט כדלקמן.

. הנה, D הוא מינון התרופה; Dm הוא המינון חציון-אפקט; הפא הוא השבר מושפע המנה; מ' הוא המעריך שמסמל את הצורה של מינון-אפקט מגרש¹. המינון חציון-אפקט משמש כדי לחשב את המינון Dx של התרופה מעכב או הורג "x" אחוזים של תאים. הערך CI לאחר מכן מחושב כדי להעריך את השפעת השילוב סמים, כדלקמן¹מוספים.

הערך CI 1 מציין אפקט תוסף וערך CI של < 1 מציין אפקט סינרגיסטי, בעוד ערך CI של > 1 מציין הטינה¹. היישום של שיטה זו נוספת בהנחייתם של הזמינות של תוכנית מחשב, CompuSyn, הקובע הסינרגטיות של אנטגוניזם במינונים כל או רמות ההשפעה הדמיה אוטומטית¹².

הקבוצה שלנו פיתח ייחודיים 8B6 mAb O-אצטיל-GD2 ganglioside (OAcGD2) נוירובלסטומה אנטיגן¹³ , נוספת הדגימו כי mAb הזה הוא מסוגל לגרום מוות של תאים עם תכונות של אפופטוזיס¹¹. כדי לבדוק אם mAb 8B6 יכול לרגש לתאי נוירובלסטומה topotecan הסוכן antineoplastic, שינינו את השיטה הנ ל שפותחה על ידי צ'או¹. ראשית, אנו לקבוע מנה אפקטיבית (אד₅₀) 50 הערכים של mAb 8B6 ו- topotecan. בשלב הבא, התאים נוירובלסטומה עם יחס equipotent של שתי תרכובות בהתבסס על אד₅₀ ערכים נחשפים לקבוע את הערכים CI שימוש בתוכנת סימולציה הנ. שיטה זו מאפשרת לנו להפגין הסינרגטיות בין mAb 8B6 ו- topotecan חוץ גופית בתוך. בשלב הבא, אנו מתארים את פרוטוקול להעריך עוד יותר את העוצמה והביטחון של שילוב משטר זה ויוו. פרוטוקול זה ניתן להחיל בקלות כדי לבחור mAb נגד סרטן חזק ובטוח ושילובים הסוכן כימותרפיות במחקרים פרה. ייצוג סכמטי של מחקר זה מסופק באיור1.

Protocol

דיור בעלי חיים, ניתוח ניסיוני אושרו על ידי הממשלה הצרפתית (הסכמי #C44-278, #APAFIS 03479.01). טיפול בבעלי חיים ונהלים נערכו תחת הוראת האיחוד האירופי 2010/63/האיחוד האירופי ומשפט צרפתית #2013-118 בנושא ההגנה על בעלי חיים משמשים למטרות מדעיות.

1. הערכה של סמים האינטראקציה בין mAb 8B6 ו Topotecan ב חוץ גופית

1. הכנת הדוגמא 96-ובכן
   התראה: להתייעץ עם ועדת בריאות ובטיחות של המוסד, רגולציה מקומית לחוקים הקשורים לבטיחות מעבדה. סקור את חומר ומידע גיליון בטיחות לפני שעבדה עם כל המדיה, שורות תאים או נוגדנים. השתמש סטרילי טכניקה נכונה ולעבוד תא למינארי. כל פתרונות/הציוד המשמשים לטיפול תאי חייב להיות סטרילי.
   הערה: פרוטוקול הבאים תוכנן לשימוש עם תאים חסיד. שינויים נדרשים להחיל את השיטה על תאים nonadherent גדל ההשעיה; פרוטוקול זה משתמש ארבע פעמים עבור כל תנאי הניסוי.
   1. לגדול IMR5 תאים בבקבוקון T75.
   2. ביום הראשון (יום 0), לבחון את התרבות תאים במיקרוסקופ כדי לבדוק את confluency תא. האחות התא האמצעי הבקבוק, לשטוף אותו עם 5 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 3 מ"ל של 0.05% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) / PBS פתרון. להחזיר את הבקבוקון החממה במשך 3 דקות (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
   3. לבחון את התרבות תאים במיקרוסקופ על ניתוק התא.
      הערה: במקרה הצורך, לחזור את הבקבוקון החממה למשך דקות 3 עד 5 נוספים, בהתאם לסוג תאים סרטניים.
   4. להוסיף 10 מ של התא מלא בינוני הבקבוק ולהעביר התליה תא ל צינור חרוטי סטרילי 15 מ"ל. Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב x 300 גרם. לספור את התאים באמצעות hemocytometer.
   5. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר תא במדיום גידול מלאה. לכוון את עוצמת הקול בינונית בריכוז הסופי של עונה 1 פרק 10⁵ תאים/מ ל....
   6. זרע 84 בארות של צלחת 96-ובכן תרבות עם 10 תאים⁴ , כל אחד, אשר הוא 100 µL תא השעיה. בצע את הפריסה ניסיוני באיור 2.
   7. דגירה את התאים עבור 18 h בחממה תא (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
2. הכנה פתרון סמים
   הערה: ללימודים רגישות עולה סמים/mAb, לשנות את התזמון האורך, ריכוז הטיפול שיתאים מיוחד הסם/mAb המדובר. שים לב הריכוז ההתחלתי הוא 3 x הריכוז הסופי.
   1. למחרת בבוקר (יום 1), להכין את הפתרונות הבאים סמים באמצעות מדיום הגידול מלאה.
      1. mAb פתרון הכנה
         1. לדלל mAb ב 500 µL של מדיום הגידול מלאה להשגת פתרון עובד נוגדן ריכוז mAb של 240 µg/mL.
         2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
      2. Topotecan פתרון הכנה
         1. שתדללו, כמו לעיל, לסם µL 500 של מדיום הגידול מלאה להשגת הפתרון עובד סמים עם ריכוז סופי של 120 ננומטר.
         2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
      3. הכנה פתרון נוגדן וסמים
         1. לדלל את הפתרונות mAb והסמים ב 500 µL של מדיום הגידול מלאה להשגת פתרון 120 ננומטר סמים, mAb µg 240/mL (הפתרון עובד).
         2. לבצע חמש כפולה דילולים טורי כמצוין באיור2.
   2. כדי להגיע הריכוז הסופי, להעביר 50 µL של כל פתרון סמים לתוך הבארות המתאים, כפי שמצוין בפריסה ניסיוני ( איור 2).
      הערה: להעביר 50 µL של מדיום הגידול מלאה לתוך הבארות התא אינו מטופל, כמצוין באיור2.
   3. דגירה את התאים עבור 72 h בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂).
3. MTT assay
   1. להוסיף 10 µL MTT ריאגנט פתרון טוב לכל.
   2. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
   3. להוסיף 100 µL של פירוק פתרון (10% מרחביות ב 0.01 M HCl) כל טוב, באמצעות פיפטה רב-ערוצי, לערבב ביסודיות על ידי pipetting.
   4. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות בתוך תא humidified (95% לחות).
   5. לקרוא את ספיגת-570 nm (₅₇₀) ו 620 nm (₆₂₀) באמצעות ספקטרופוטומטרים.
      הערה: לערבב כל מדגם שוב על ידי pipetting לפני קריאת את ספיגת; ספיגת-620 nm מאפשר את התיקון של ערכי הרקע לא ספציפית.
   6. לחשב את ספיגת המתוקן: תוקן ספיגת =₅₇₀-₆₂₀.
   7. לחשב את הכדאיות תא כדלקמן: תא הכדאיות = 100 x (דוגמה רעה ספיגת המתוקן / לשלוט כלומר ספיגת המתוקן).
   8. לחשב את מושפעות שבר ערכי (Fa) באמצעות המשוואה הבאה: 1 - (דוגמה רעה ספיגת המתוקן / לשלוט כלומר ספיגת המתוקן).
4. סמים אינטראקציה עם תוכנת הדמיה אנליטיים ליחיד ולימודי שילוב סמים
   1. להפעיל את תוכנת סימולציה כדי לפתוח את החלון התחלה.
   2. לחץ על הלחצן ' ניסוי חדש ' כדי לפתוח את החלון הראשי .
   3. הקלד את השם של הניסוי בחלון שם .
      הערה: ניתן להוסיף תאריך בחלון תאריך .
   4. לחץ על לחצן תרופה יחידה חדשה .
   5. הקלד את השם בחלון שם מלא .
   6. הקלד את הקיצור בחלון Abbrev .
   7. הקלד את יחידת ריכוז סמים בחלון יחידות .
   8. הזן נתונים נקודה 1 מנה ערך פא, הקש Enter.
   9. חזור על שלב זה עד לכל נקודות הנתונים מוזנים.
   10. לחץ על הלחצן ' סיום '.
   11. בצע את השלבים אותם להיכנס mAb נקודות נתונים.
       הערה: השתמש מאותה יחידה ריכוז נמצא בשימוש בסמים.
   12. לחץ על לחצן חדש התרופה המשולבת .
   13. בחר סמים mAb.
   14. בחר יחס קבוע ולחץ על אישור.
   15. הקלד את השם בחלון שם מלא .
   16. הקלד את הקיצור בחלון Abbrev .
   17. הקלד את היחס סמים/mAb בחלון יחס .
   18. הזן נתונים נקודה 1 מנה והקש Enter.
       הערה: התוכנית באופן אוטומטי יחשב את המנות של mAb ותיבה משולבת.
   19. הזן את ערך הנתונים נקודה 1 פא והקש Enter.
   20. חזור על שלב זה עד לכל נקודות הנתונים מוזנים.
   21. לחץ על הלחצן ' סיום ', לאחר מכן, לחץ על לחצן צור דוח .
   22. בחר mAb והסמים ולאחר מכן, לחץ על אישור.
   23. בחר משולבת ולאחר מכן, לחץ על אישור.
   24. בחר כותרת טבלה CI, טבלת סיכום. לאחר מכן, לחץ על אישור.
   25. הקלד את שם הקובץ של קובץ ה-ניתוח ולחץ על שמור כדי ליצור את הדוח.
       הערה: לאחר לחיצה על אישור, הדו ח ייפתחו באופן אוטומטי דפדפן ברירת המחדל של המחשב.
   26. כדי להדפיס את הדוח, בחר הדפסה בתפריט קובץ של דפדפן האינטרנט. הדוח מכיל מקטע טבלת סיכום הכולל את הכותרת, תאריך, שם הקובץ, הערה תיאור, פרמטרים (מ', מיט ו r), אד₅₀ עבור סוכן או משמש יחידני או בכל שילוב, והטבלה CI עבור כל שילוב אד₅₀, אד ₇₅, אד₉₀, ואד₉₅.
       הערה: ערך CI של < 1 מציין הסינרגטיות, הערך CI = 1 מציין additivity, וערך CI של > 1 מציין אנטגוניזם.

2. דור של נוירובלסטומה האנושי Xenografts בעכברים Scid גמא Nonobese הנד סוכרתית (NSG עכברים)

הערה: הכללת כל זיהום של התרבות תאים. מאז המטריקס קרום המרתף יוצר ג'ל מעל 5 ° C, כל אורח/ים ילד/cultureware או מדיה במגע עם קרום המרתף מטריקס הכימית צריך להיות prechilled/קר כמו קרח. לשמור על המטריקס קרום המרתף על קרח במהלך התהליך כולו.

1. הכנה של התליה תא IMR5
   1. הפשרת הכימית מטריקס קרום המרתף בן לילה על ידי השוקע המבחנה בקרח במקרר 4 ° C לפני השימוש.
   2. ביום 0, לקצור את IMR5 תאים בתרבית כמפורט לעיל.
   3. העבר את התאים צינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב x 300 גרם במשך 5 דקות.
   4. למחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את התאים 2 x עם 15 מ"ל של PBS קר כקרח, ולהכין תא השעיה של 5 x 10⁷ תאים/מ ב- PBS קר כקרח.
      הערה: אם יש צורך, להעביר התליה תא לרכבת התחתית microcentrifuge 1.5 mL.
   5. מערבולת המבחנה מטריקס קרום המרתף.
      הערה: הכימית מטריקס קרום המרתף צריך להיות הקרת, התפזרו.
   6. להוסיף אמצעי אחסון אחד של קרום המרתף מטריקס ריאגנט ולערבב אותו על-ידי pipetting כדי לקבל השעיה תא של 2.5 x 10⁷ תאים /mL.
   7. לשמור על התליה תא על קרח.
2. הכנה של העכברים
   הערה: העכברים צריך להיות בן 6-7 שבועות.
   1. לשמור על עכברים תחת תנאי ספציפי פתוגן-חופשית.
   2. לאפשר תקופת הסתגלות שלושה - חמישה ימים לאחר העכברים הגיעו.
   3. ביום של חיסון, לגלח את האגף היכן הזריקה יהיה (ראה שלב 2.3.6).
3. הכנה של הזריקה תא הגידול
   הערה: לשמור את המתלה תא קר כקרח קרום המרתף מטריקס aseptic לאורך כל ההליך.
   1. לערבב את התאים, בזהירות לצייר התליה תא לתוך מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 21 G.
   2. בדוק כדי לוודא שאין אין בועות אוויר במזרק.
   3. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
   4. סחוט בעדינות את העור של העכבר לאגף בין האצבעות, במקום ההזרקה.
   5. הכנס את המחט בדיוק לקפל את העור. אין למקם את המחט עמוק לתוך הרקמה כדי להבטיח זריקה תת עורית.
   6. להזריק 100 µL IMR5 תא השעיה (קרי, 2.5 x 10⁶ תאים) subcutaneously לתוך באגף הימני התחתון של העכברים.
   7. לסובב את המזרק כדי למנוע דליפה, לשלוף את המחט.
4. מעקב אחר שינויים במשקל הגוף ואת הגידול
   1. למדוד את האורך (א) ורוחב (ב) של הגידול עם קליבר.
   2. לחשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה (א x B²) x 0.5.
   3. להתחיל טיפול כאשר הגידולים הגיעו בכמות ממוצעת של ~ 50-60 מ מ³.

3. סמים המינהל נוגדן בעכברים

1. עירוי לוריד של mAb 8B6
   1. בזהירות ממלאים מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 25 גרם mAb פתרון....
   2. הנח את העכבר מתחת למנורת חום למשך 10 דקות להתרחב את הווריד הזנב.
   3. לרסן את העכבר restrainer מכרסמים.
   4. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
   5. את המחט במקביל לוריד הזנב, 2-4 מ מ חודר לתוך לומן תוך שמירה על שיפוע של המחט הפנים כלפי מעלה (איור 3 א).
   6. מזריקים µL 100 של נוגדן פתרון לווריד (העירוי).
   7. עם סיום ההזרקה, בעדינות לחץ ההזרקה כדי למנוע דימום.
2. בקרום הבטן מינהל topotecan
   1. לצייר את הפתרון סמים בתוך מזרק 1 מ"ל רכוב עם מחט 25 גרם.
   2. החזק את העכבר במצב פרקדן, עם הקצה האחורי מעט יותר גבוהה מהרגיל.
   3. לחטא את האזור חיסון של העכבר באמצעות פתרון חיטוי.
   4. אתר קו האמצע בבטן של העכבר ולחץ נפשית לחלק את הבטן הגזרות. אתר ההזרקה ברביע הימני או השמאלי התחתון (איור 3B).
   5. הכנס את המחט לתוך. חלל הבטן (5 מ מ עמוקה) ב ~ 10° זווית, ברביע התחתון ימינה או שמאלה.
   6. להזריק 100 µL של סמים פתרון intraperitoneally (i.p.).
   7. לחטא את האתר חיסון.

תוצאות

התוצאות נציג ודמויות מותאמים באישור מוקדם יותר לאור העבודה¹⁴.

8B6 mAb anti-OAcGD2 משפר בסינרגיה אפקטים המעכבת של Topotecan על צמיחת שורת תאים נוירובלסטומה:

כדי ליצור את התרופה ריכוז נוגדן כדי לשמ...

Discussion

כדי לחזות את התוצאה של תגובות בין תרופתיות, ניתן להשתמש בשלוש שיטות: מתודולוגיה isobologram¹⁷, מודל לא-ליניאריות תערובת¹⁸ו השילוב מדד¹. ניתוח מדד משולב הוא הנפוץ ביותר בשימוש כי היישום שלה היא פשוטה בשל הזמינות של תוכנית מחשב ידידותי למשתמש. למטרה זו, אנו קוד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation kit (MTT)	Roche	11-465-007-001
CompuSyn software	ComboSyn		Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver	Bioseb	BIO-1556
Fetal calf serum	Eurobio	CVFSVFF00-01	10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox	Mozilla Corporation		Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp	Verre&Quartz	4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line	Accegen Biotechnology	ABC-TC0450	IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine	Gibco	25030-024	2 mM in RPMI 1640
Lysis solution	Roche	11-465-007-001
mAb 8B6	University of Nantes	N/A
Matrigel	Corning	354248
Multiskan FC	Thermofischer Scientific	N08625
Needle 21G 1 ½	BD Microlance	304432
Needle 25G 1	Terumo	NN-2525R
NSG mice	Charles River Laboratories	5557
Nunc MicroWell 96-well microplates	Thermofisher	167008
PBS	VWR	L182-10
PBS, 0,05% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
PC that runs windows 7	Microsoft		Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir	Thermofischer Scientific	8094
Rodent restrainer	Bioseb	TV-150-SM
RPMI 1640	Gibco	31870-025
Syringe 1 mL	Henke Sass Wolf	5010.200V0
Topotecan	Sigma-Aldrich	T2705