Potentiation Antineoplastic 약물으로 항 암 항 체 효능: 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 체-마약 성분의 검출

요약

이 프로토콜 Chou와 Talalay 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 항 체와 전 임상 모델에서 antineoplastic 마약 성분 평가 하는 방법을 설명 합니다.

초록

적대적 단일 클론 항 체 (mAb) 화학요법 에이전트에 의해 potentiation 암에 대 한 효과적이 고 안전한 치료 설계를 위한 중요 한 전략을 구성 합니다. 여기 우리는 전 임상 단계에서 합리적인 조합을 식별 하는 프로토콜을 제공 합니다. 첫째, 우리는 Chou와 Talalay¹의 조합 인덱스 방정식을 사용 하 여 항 암 제 mAb 및 세포 독성 약물 사이 성분 평가 셀 기반 분석 결과 설명 합니다. 측정의 종양 세포 약물 및 항 체-감도 MTT 분석 결과, 다음 조합 색인 (CI) 값을 계산 하는 자동화 된 컴퓨터 분석을 사용 하 여 포함 됩니다. CI 값 < 1 성분 테스트 mAbs와 세포 독성 대리인¹사이 나타냅니다. 생체 외에서 연구 결과 vivo에서승산이 더이 종이 식 종양 모델에서 조합 처방 효능을 평가 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델에서 결합 된 처방 크게 종양의 성장, 단일 에이전트 컨트롤에 비해 상당한 확장된 생존에 어떤 결과 지연 합니다. 중요 한 것은, vivo에서 실험 보여 조합 식이요법 잘 용납입니다. 이 프로토콜에는 항 암 약물 조합 전 임상 모델에서의 효과적인 평가 임상 시험에서 평가 하는 합리적인 조합 식별 수 있습니다.

서문

많은 암 종류의 치료에 접근 하는 기존의 방식은 monotherapy에 근거 했다. 경우에 그것은 여전히 많은 경우에 사용 하 고,이 방법이 결합된 요법²선택에 지도 하는 몇 가지 장애물을 만났다. 특히, 암 세포 개발 대안 생존 메커니즘³, 치료 실패 환자⁴결과 유도 하 여 단일 약물으로 치료 하면 저항을 더 따르게 됩니다. 또한, monotherapy에 약은 높은 복용량에서 관리 일반적으로. 이 상황을 자주 참을 수 의사 치료²중지를 강제로 수 있는 강한 복용량 의존 부작용의 발생에 발생 합니다. 이러한 이유로 항 암 분자의 협회는 지금 monotherapy 선호.

이상적인 약물 조합 정상 세포에 대 한 증가 독성 없이 종양 세포에 대 한 시너지에 행동 하는 그 것입니다. 성분 치료 효과 별도로 행동 하는 각 개별 약물의 합계 보다 큰 두 개 이상의 약물의 상호 작용을 말합니다. 이러한 상호 작용은 향상 된 임상 치료 효능²발생할 수 있습니다. 그것은 치료 저항을 제한, 효능, 증가 하 고 또한 독성²를 줄일 수 있습니다. 사실, 다른 경로 대상으로 그들의 부작용을 낮은 각 약물의 복용량을 줄일 수 있습니다. 또한, 분자의 하나 또한 암 세포에 대하여 sensitizing 요원으로 사용할 수 있습니다. 적은 복용량 사용된⁵수 그리고 두 번째 약물의 효과 민감하게 셀에 향상 될 수 있습니다.

결합된 치료는 화학요법 약물 및 생물 의약품, 단일 클론 항 체⁶등 두 개 이상 포함할 수 있습니다. 이러한 mAbs 특별히 대상으로 관심과 항 체 의존 세포 매개 세포 독성 (ADCC)를 포함 하 여 면역 경로 통해 종양 세포를 죽 일 수의 세포 표면 항 원 표출 세포 면역 효과 기 세포의 참여와 ⁷, 그리고 보완 의존 세포 독성 (CDC)⁶. 그들은 또한 메커니즘을 통해 비 면역학 apoptosis^8,9,,1011중재 역할 수 있습니다. 이 경우에, 프로그램 된 세포 죽음의 과정의 유도 고 수 있습니다 암 세포를 민감하게, 그들의 기능을 약하게 관련된 화학요법 약물 더 효과적인 낮은 복용량에. 이와 같이, proapoptotic mAb antineoplastic 약물 조합 식이요법을 디자인을 위한 좋은 후보자 이다.

다른 수학적 모델 마약 성분; 평가 설명 되었습니다. 그들 중 하나는 결합 인덱스 방법¹을 기반으로 합니다. 이 방법은 추¹에 의해 개발 된 중간값 효과 원리를 기반으로 합니다. 중간값 효과 방정식 상관 약 복용량 및 약물 효과 다음과 같이 한다.

여기서, D 는 약 복용량; Dm 은 중간값 효과 복용량; Fa 는 분수; 복용량에 의해 영향을 m 복용량 효과 플롯¹의 모양을 의미 하는 지 수입니다. 중간값 효과 복용량은 dx 를 억제 또는 셀의 "x" % 죽이고 약물의 복용량을 계산 하는 데 사용 됩니다. CI 값¹을 다음과 같이 약물 조합의 첨가제 효과 평가 하기 위해 다음 계산 됩니다.

CI 값 1 나타냅니다 첨가제 효과 CI 값 < 1 >의 CI 값 하면서 시너지 효과 나타냅니다 1 적개심¹나타냅니다. 이 방법의 응용 프로그램은 컴퓨터 프로그램, CompuSyn, 성분 및 모든 복용량에서 적개심 결정 하는의 가용성에 의해 촉진 추가 또는 효과 레벨 시뮬레이션 자동으로¹².

우리의 그룹 오 틸 g d 2 ganglioside (OAcGD2) 신경 항 원¹³ mAb 8B6 특정 개발과이 mAb는 apoptosis¹¹의 특성을 가진 세포 죽음을 유도 수 입증 했다. MAb 8B6 antineoplastic 요원 topotecan 신경 세포를 민감하게 할 수 있는지 여부를 테스트 하려면 우리는 위에서 언급 한 방법 추¹에 의해 개발 된 적응. 첫째, 우리는 mAb 8B6 및 topotecan의 효과적인 복용량 50 (에 드₅₀) 값을 결정합니다. 다음,에 드₅₀ 값에 따라 두 화합물의 equipotent 비율 신경 세포 위에서 언급 한 시뮬레이션 소프트웨어를 사용 하 여 CI 값을 결정 하기 위해 노출 됩니다. 이 방법은 mAb 8B6 및 topotecan 시험관사이 성분 설명 수 있습니다. 다음, 우리는 더이 조합은 처방에서 vivo에서의 안전과 효능을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 전 임상 연구에서 강력 하 고 안전한 항 암 mAb 및 화학요법 에이전트 조합 선택에 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 연구의 도식 대표는 그림 1에 제공 됩니다.

프로토콜

동물 주택 및 실험 절차 (계약 #C44-278와 #APAFIS 03479.01) 프랑스 정부에 의해 승인 되었다. 동물 보호 및 절차 #2013-118 과학적인 목적을 위해 사용 하는 동물의 보호에 지시문 EU 2010/63/EU 및 프랑스 법에서 실시 했다.

1. mAb 8B6 약물 상호 작용 사이 Topotecan 체 외에서 평가

1. 96-잘 샘플 준비
   주의: 기관의 건강과 안전 위원회를 참조 하 고 실험실 안전에 관련 된 지역 규제 규칙을 따릅니다. 모든 미디어, 셀 라인, 또는 시 약을 사용 하기 전에 재료 안전 데이터 시트 정보를 검토 합니다. 적절 한 무 균 기술을 사용 하 고 층 류 두건에서 작동. 셀을 조작 하는 데 사용 되는 모든 솔루션/장비 살 균 해야 합니다.
   참고: 다음 프로토콜 부착 세포와 함께 사용 하기 위해 설계 되었습니다. 수정 nonadherent 셀에; 성장에 메서드를 적용 하는 데 필요한 이 프로토콜은 각 실험 조건에 대 한 quadruplicate를 사용합니다.
   1. T75 플라스 크에 IMR5 세포 성장.
   2. 첫 날 (0 일), 셀 confluency 확인을 현미경으로 세포 배양을 관찰 합니다. 플라스 크에서 셀 중간 발음, 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 5 mL와 함께 그것을 씻어 하 고 0.05 %ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)의 3 개 mL를 추가 / PBS 솔루션. (37 ° C, 5% CO₂) 3 분 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다.
   3. 셀 분리에 대 한 현미경으로 세포 배양을 검사 합니다.
      참고: 필요한 경우 종양 세포 유형에 따라 추가 3 ~ 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 반환 합니다.
   4. 완전 한 세포 매체의 10 mL 플라스 크에 추가 하 고 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 300 x g에 5 분에 대 한 셀 원심 hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
   5. 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 완전 한 성장 매체에 셀 펠 릿을 resuspend. 1 x 10⁵ 셀/mL의 최종 농도를 중간 볼륨을 조정 합니다.
   6. 세포 현 탁 액의 100 µ L은 각, 10⁴ 셀 96 잘 문화 접시의 씨 84 우물 그림 2에 표시 된 실험 레이아웃을 따릅니다.
   7. (37 ° C, 5% CO₂) 세포 배양 기에 18 h에 대 한 셀을 품 어.
2. 마약 솔루션 준비
   참고: 마약/mAb 민감성 연구, 타이밍, 길이 및 집중 치료는 특정 약물/mAb 질문에 맞게 수정 합니다. 참고 초기 농도 3 배 최종 농도 이다.
   1. 다음날 아침 (주 1), 완전 한 성장 매체를 사용 하 여 다음 마약 솔루션을 준비 합니다.
      1. mAb 솔루션 준비
         1. MAb 240 µ g/mL의 mAb 농도와 항 체 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 희석.
         2. 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
      2. Topotecan 솔루션 준비
         1. 희석로 위, 120의 최종 농도와 약물 작업 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에 약 nM.
         2. 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
      3. 항 체 및 약물 솔루션 준비
         1. 120 nM 약물 및 240 µ g/mL mAb (작업 솔루션)에 솔루션을 얻기 위해 완전 한 성장 매체의 500 µ L에서 약물 및 mAb 솔루션을 희석.
         2. 그림 2에 표시 된 대로 5 개의 두 배 직렬 희석을 수행 합니다.
   2. 실험적인 레이아웃 ( 그림 2)에 표시 된 대로 최종 농도에 도착, 해당 우물에 각 약물 솔루션의 50 µ L를 전송.
      참고: 그림 2에 표시 된 대로 치료 셀 우물에 완전 한 성장 매체의 50 µ L를 전송.
   3. (37 ° C, 5% CO₂) 인큐베이터에서 72 h에 대 한 셀을 품 어.
3. MTT 분석 결과
   1. 각 우물에 MTT 시 솔루션의 10 µ L를 추가 합니다.
   2. 37 ° C 4 h에서 품 어.
   3. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 각 음에 lysis 용액 (0.01 M HCl에 10 %SDS) 100 µ L을 추가 하 고 pipetting으로 철저 하 게 혼합.
   4. 37 ° C 습도 챔버 (95% 습도)에 4 h에서 품 어.
   5. 570에서 흡 광도 읽고 (₅₇₀) 및 620 nm (₆₂₀)는 분 광 광도 계를 사용 하 여.
      참고: 각 샘플 흡 광도; 읽기 전에 pipetting으로 다시 믹스 흡 광도에서 620 nm 일반적인 배경 값의 수정 수 있습니다.
   6. 수정 된 흡 광도 계산: 수정 흡 광도는₅₇₀-₆₂₀=.
   7. 세포 생존 능력을 다음과 같이 계산: 세포 생존 능력 = 100 x (평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).
   8. 계산 하는 다음 수식을 사용 하 여 분수의 영향을 받는 값 (Fa): 1-(평균 수정된 흡 광도 샘플 / 뜻 수정된 흡 광도).
4. 단일 약물 상호 작용 분석 시뮬레이션 소프트웨어 및 약물 조합 연구
   1. 시작 창을 열려면 시뮬레이션 소프트웨어를 실행 합니다.
   2. 새로운 실험 버튼을 메인 창을 클릭 합니다.
   3. 이름 창에서 실험의 이름을 입력 합니다.
      참고: 날짜 날짜 창에 추가할 수 있습니다.
   4. 새로운 단일 약물 버튼 클릭 합니다.
   5. 전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.
   6. Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.
   7. 단위 창에서 약물 농도 단위를 입력 합니다.
   8. 입력 데이터 포인트 1 복용량 및 Fa 값, Enter키를 누릅니다.
   9. 모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
   10. 마침 버튼을 클릭 합니다.
   11. MAb 데이터 포인트를 입력 하는 동일한 단계를 따릅니다.
       참고: 약물 사용은 동일한 농도 단위를 사용 합니다.
   12. 새로운 약물 콤보 버튼 클릭 합니다.
   13. 약물 및 mAb를 선택 합니다.
   14. 일정 비율 을 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
   15. 전체 이름 창에 이름을 입력 합니다.
   16. Abbrev 창에 약어를 입력 합니다.
   17. 마약/mAb 비율의 비율 창에서 입력 합니다.
   18. 데이터 포인트 1 복용량 을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다.
       참고: 프로그램 자동으로 mAb 및 콤보의 복용량 계산 됩니다.
   19. 데이터 포인트 1 Fa 값을 입력 하 고 Enter키를 누릅니다.
   20. 모든 데이터 요소는 입력 될 때까지이 단계를 반복 합니다.
   21. 마침 버튼을 클릭 하 고, 보고서 생성 버튼을 클릭 합니다.
   22. 약물 및 mAb를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
   23. 콤보 를 선택 하 고 확인을 클릭 합니다.
   24. 헤더, CI 테이블및 요약 테이블을 선택 합니다. 그런 다음 확인을 클릭 합니다.
   25. 분석 파일의 파일 이름을 입력 하 고 보고서를 생성 하기 위해 저장 을 클릭 합니다.
       참고: 확인을 클릭 하면 보고서 자동으로 열립니다 컴퓨터의 기본 웹 브라우저에서.
   26. 보고서를 인쇄 하려면 웹 브라우저의 파일 메뉴에서 인쇄 을 선택 합니다. 보고서 포함 어느 에이전트에 드₅₀, ED _{에서 각 조합에 대해 monotherapy 또는 조합, 및 CI 테이블 사용에 대 한 제목, 날짜, 파일 이름, 설명 참고, 매개 변수 (m, Dm, 및 r)에 드50 를 포함 하는 요약 테이블 섹션 75}에 드₉₀및₉₅에 드.
       참고: CI 값 < 1 나타냅니다 성분, CI 값 = 가산, 그리고 CI 값 1 나타냅니다 > 1 적개심을 나타냅니다.

2. 인간의 신경 Xenografts Nonobese 당뇨병 끄 덕 Scid 감마 생쥐 (NSG 쥐)의 생성

참고: 세포 배양의 어떤 오염 든 지를 제외 합니다. 5 ° C의 위 젤을 형성 하는 지하실 멤브레인 매트릭스, 이후 모든 cultureware 또는 미디어 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약의 만남 prechilled/얼음-감기 해야 합니다. 전체 과정에서 얼음 지하실 멤브레인 매트릭스를 유지.

1. IMR5 세포 현 탁 액의 준비
   1. 사용 하기 전에 4 ℃ 냉장고에서 얼음에 유리병을 물속으로 밤새 지하실 멤브레인 매트릭스 시 약을 녹여.
   2. 0 일에 교양된 IMR5 셀으로 위의 수확.
   3. 15 mL 원뿔 튜브를 5 분에 대 한 300 x g 에서 원심 분리기는 세포를 전송 합니다.
   4. 폐기는 상쾌한. 2 세포를 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 15 mL x 5 x 10⁷ 셀/mL에 얼음 처럼 차가운 PBS의 세포 현 탁 액을 준비 하 고.
      참고: 필요한 경우 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송.
   5. 지하실 막 매트릭스 유리병을 소용돌이 친다.
      참고: 지하실 멤브레인 매트릭스 시 해 동 고 분산 될 해야 합니다.
   6. 지하실 막 매트릭스 시 약의 한 볼륨을 추가 하 고 2.5 10⁷ 셀 /mL x의 세포 현 탁 액을 pipetting으로 혼합.
   7. 얼음에 세포 현 탁 액을 유지 합니다.
2. 쥐의 준비
   참고: 쥐 6 ~ 7 주 이전 이어야 한다.
   1. 특정 병원 체 자유로운 상태에서 생쥐를 유지 합니다.
   2. 쥐 도착 후 3-5 일 순응 기간을 허용 합니다.
   3. 접종 당일 면도 측면 주사 될 것 이다 일 (단계 2.3.6 참조).
3. 종양 세포 주입의 준비
   참고: 차가운 지하실 멤브레인 매트릭스 셀 서 스 펜 션 절차 동안 무 균 유지.
   1. 세포를 혼합 하 고 신중 하 게 1 mL 주사기 21g 바늘으로 장착으로 세포 현 탁 액을 그립니다.
   2. 주사기에 없는 기포는 확실 하 게 확인 하십시오.
   3. 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
   4. 부드럽게 주사 사이트에서 손가락 측면에 마우스의 피부를 짠 다.
   5. 피부 겹에 정확히 바늘을 삽입 합니다. 바늘을 배치 하지 마십시오 피하 주입 되도록 조직에 깊이.
   6. 쥐의 더 낮은 오른쪽 측면에 IMR5 세포 현 탁 액 (즉, 2.5 x 10⁶ 셀)의 100 µ L를 피하 주사.
   7. 누설을 방지 하 고 바늘을 철회를 주사기를 회전 합니다.
4. 몸 무게 변화 및 종양 성장 모니터링
   1. 길이 (A)와 (B)는 캘리퍼스와 종양의 너비를 측정 합니다.
   2. 0.5 x (A x B²) 수식을 사용 하 여 종양 볼륨을 계산 합니다.
   3. 종양에는 50-60 m m³의 평균 볼륨에 도달 했습니다 때 치료를 시작 합니다.

3. 약물 및 생쥐에서 항 체 관리

1. MAb 8B6의 정 맥 행정
   1. 신중 하 게 작성 1 mL 주사기 25 G 바늘 mAb 솔루션 탑재.
   2. 10 분 같은데요 꼬리 정 맥 열 램프 아래에서 마우스를 놓습니다.
   3. 설치류 restrainer에 마우스를 제 지.
   4. 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
   5. 병렬 꼬리 정 맥, 관통 2-4 m m (그림 3A) 위쪽으로 바늘의 경사를 유지 하면서 루멘에 바늘을 삽입 합니다.
   6. 항 체 해결책의 100 µ L를 정 맥 주사 (i.v.).
   7. 주입이 끝나면 출혈을 방지 하기 위해 사출 사이트 압력 부드럽게.
2. Topotecan의 복 관리
   1. 25g 바늘으로 장착 1 mL 주사기에 약물 솔루션을 그립니다.
   2. 그것의 후부 끝이 약간 상승 부정사 위치에 마우스를 잡아.
   3. 소독 살 균 솔루션 마우스의 접종 지역.
   4. 마우스의 복 부 정중 선 찾아서 정신적으로 사분면으로 복 부를 분할 합니다. 오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면 (그림 3B)에서 주사 사이트를 찾습니다.
   5. 오른쪽 또는 왼쪽 하단 사분면에 ~ 10 ° 각도로 (5 m m 깊은) 복 부에 바늘을 삽입 합니다.
   6. Intraperitoneally 마약 솔루션의 100 µ L를 주사 (i.p.).
   7. 접종 사이트 소독.

결과

대표 결과 및 수치는 이전 게시 작업¹⁴허가 적응.

안티 OAcGD2 mAb 8B6 Synergistically 신경 세포 선 성장에 Topotecan의 억제 효과 향상:

하는 약물 및 항 체 농도 성분 topotecan 및 mAb 8B6, 약물 및 항 체 감도 MTT 분석 결과 사용 하 여 신경 세포가 먼저 측정 했다 인?...

토론

약물 상호 작용의 효과 예측, 세 가지 방법을 사용할 수 있습니다: isobologram 방법론¹⁷, 비선형 혼합 모형¹⁸그리고 조합 색인¹. 결합 인덱스 분석은 그것의 응용 사용자 컴퓨터 프로그램의 가용성에 의해 간단 하 게 하기 때문에 가장 일반적으로 사용 됩니다. 이 위해 우리는 먼저 MTT 분석 결과¹⁹를 수행 하 여 단독으로 또는 조합?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Proliferation kit (MTT)	Roche	11-465-007-001
CompuSyn software	ComboSyn		Combosyn can be downloaded for free at http://www.combosyn.com
Electric shaver	Bioseb	BIO-1556
Fetal calf serum	Eurobio	CVFSVFF00-01	10% heat-inactivated fetal calf serum in RPMI 1640
Firefox	Mozilla Corporation		Firefox can be downloaded for free at http://www.mozilla.org/en-US/firefox/
Heat lamp	Verre&Quartz	4003/1R
Human neuroblastoma IMR-5 cell line	Accegen Biotechnology	ABC-TC0450	IMR-5 is a clone of the human neuroblastoma cell line IMR32 5459762. IMR-5 cells were generously provided by Dr. Santos Susin (U.872, Paris, France)
L-glutamine	Gibco	25030-024	2 mM in RPMI 1640
Lysis solution	Roche	11-465-007-001
mAb 8B6	University of Nantes	N/A
Matrigel	Corning	354248
Multiskan FC	Thermofischer Scientific	N08625
Needle 21G 1 ½	BD Microlance	304432
Needle 25G 1	Terumo	NN-2525R
NSG mice	Charles River Laboratories	5557
Nunc MicroWell 96-well microplates	Thermofisher	167008
PBS	VWR	L182-10
PBS, 0,05% EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
PC that runs windows 7	Microsoft		Windows 7 can be purchased at http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	100 units/mL penicillin and 100 mg/mL streptomycin in RPMI 1640
Reagent reservoir	Thermofischer Scientific	8094
Rodent restrainer	Bioseb	TV-150-SM
RPMI 1640	Gibco	31870-025
Syringe 1 mL	Henke Sass Wolf	5010.200V0
Topotecan	Sigma-Aldrich	T2705