تحليل الغشاء ثايلاكويد البروتين المجمعات بالتفريد جل الأصلي الأزرق

Summary

بروتوكول لاستجلاء هذه النباتات ثايلاكويد البروتين منظمة معقدة وتكوينها مع الأزرق polyacrylamide الأصلي هلام التفريد (BN-صفحة) وهو وصف 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول هو الأمثل التمويل نبات، ولكن يمكن استخدامها للأنواع النباتية الأخرى مع تعديلات طفيفة.

Abstract

سلسلة نقل الإلكترون الضوئي (إلخ) بتحويل الطاقة الشمسية إلى طاقة كيميائية على شكل ATP و NADPH. أربعة مجمعات البروتين الكبيرة المضمنة في غشاء ثايلاكويد حصاد الطاقة الشمسية لدفع الإلكترونات من الماء إلى NADP⁺ عن طريق فوتوسيستيمس اثنين، واستخدام التدرج بروتون الذي تم إنشاؤه لإنتاج ATP. بسيي Photosystem، هذه المبادرة والسيتوكروم ب₆و (و₆ب سيت) ATPase جميع مجمعات مولتيبروتين مع التوجه متميزة والديناميات في غشاء ثايلاكويد. يمكن الحصول على معلومات قيمة حول تكوين وتفاعلات البروتين المجمعات في غشاء ثايلاكويد قبل سولوبيليزينج المجمعات من سلامة الغشاء بالمنظفات خفيفة تليها هلام الأصلية فصل الغرواني الكهربي المجمعات. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب تحليلية المستخدمة لفصل البروتين المجمعات في شكلها الأصلي والوظيفية. يمكن استخدام الأسلوب لتنقية البروتين معقدة للتحليل الهيكلي أكثر تفصيلاً، ولكنه يوفر أيضا أداة لتشريح التفاعلات الدينامية بين مجمعات البروتين. تم تطويره لتحليل البروتين التنفسية المتقدرية المجمعات، الأسلوب ولكن منذ ذلك الحين تم الأمثل وتحسين لتشريح مجمعات البروتين ثايلاكويد. هنا، نحن نقدم بروتوكول حديثة مفصلة لتحليل البروتين التمثيل الضوئي مجا المجمعات وتفاعلاتها في نبات التمويل.

Introduction

فوتوسيستيم مجمعات كبيرة من البروتين مولتيسوبونيت هذه المبادرة وبسيي، سيت ب₆و و ATPase تنسيق إنتاج NADPH و ATP في التمثيل الضوئي الضوء ردود. في أعلى النباتات المعايشة، تقع المجمعات في الغشاء ثايلاكويد، الذي بنية غشاء هيكلياً غير متجانسة، تتألف من أبريسيد وجرانة وسدى غير أبريسيد ثيلاكويدس. هلام polyacrylamide الأصلي الأزرق التفريد (BN-صفحة) أسلوب المستخدمة على نطاق واسع في التحليل للمجمعات الكبيرة من البروتين مولتيسوبونيت في شكلها الأصلي والنشيطة بيولوجيا. الأسلوب أنشئت لتشريح غشاء الميتوكوندريا البروتين المجمعات¹، ولكن في وقت لاحق تم تخصيصها لفصل البروتين المجمعات من شبكة غشاء ثايلاكويد³. الأسلوب مناسب (ط) لتنقية ثايلاكويد الفردية البروتين المجمعات للتحليل الهيكلي، (الثاني) لتحديد التفاعلات الأصلي بين مجمعات البروتين و (ثالثا) لتحليل التنظيم العام للبروتين المجمعات عند تغيير منبهات بيئية.

قبل الانفصال، البروتين المجمعات المعزولة من الغشاء مع المنظفات النطاق يتم اختيارها بعناية، وعموما معتدل والمحافظة على البنية الأصلية للبروتين المجمعات. المنظفات تحتوي على عمود المصباح ومواقع ماء والمذيلات مستقرة النموذج أعلاه تركيز معينة، دعا إلى تركيز micellar حرجة (CMC). زيادة تركيز المنظفات أعلى نتائج اللجنة العسكرية المركزية في اضطراب التفاعلات الدهنية الدهن وفي سولوبيليزاتيون من البروتين المجمعات. ويتوقف اختيار المنظفات على استقرار البروتين المعقدة للفائدة وعلى القدرة سولوبيليزيشن لمواد التنظيف. وتشمل المنظفات المستخدمة بشكل روتيني α/β-دوديسيل-مالتوسيدي وديجيتونين. بعد solubilization مجمعات البروتين في دولته الأصلية، يتم إزالة المواد غير قابلة للذوبان بالطرد المركزي. في النباتات العليا، الغشاء ثايلاكويد اختلاف كبير في هيكل وبعض المنظفات (مثلاً، ديجيتونين) بشكل انتقائي جعل سوى جزء محدد من الغشاء³. ولذلك، تميز المنظمة البروتين المعقدة أو التفاعلات بين مجمعات البروتين، من الأهمية بمكان لتحديد قدرة solubilization المنظفات المختار دائماً بتحديد محتوى الكلوروفيل والكلوروفيل/b نسبة من المادة طافية لتقييم العائد والمجال ثايلاكويد ممثلة (الفرعية)، على التوالي، في كسر solubilized. نسبة الكلوروفيل/b في ثيلاكويدس سليمة للنمو-الضوء تأقلم النباتات هي عادة حوالي 3، بينما شيلي قيمة ب الكسور ثايلاكويد أثري أما في وجرانة أو ثيلاكويدس ستروما يقع أسفل (~ 2.5) أو تجاوز قيمة الإجمالي (~ 4.5) ثيلاكويدس، على التوالي.

تقديم شحنة سالبة لمجمعات البروتين، يتم إضافة صبغ (مصرف البحرين المركزي) الزرقاء الرائعة أخذ العينة solubilized. سبب تحول التهمة، ترحيل نحو اﻷنود مجمعات البروتين ويتم فصل على تدرج اكريلاميد (أإ) حسب الكتلة الجزيئية والشكل. ويتحقق الفصل فعالة وعالية الدقة باستخدام تدرج تركيز اكريلاميد خطي. أثناء التفريد، ترحيل مجمعات البروتين نحو اﻷنود حتى تصل إلى حد حجم المسام تعتمد على الحجم. حجم المسام من جل polyacrylamide يعتمد على الاكريلاميد (ط) مجموع/مكررا-اكريلاميد تركيز (T) و (ثانيا) على كروسلينكير مكررا-اكريلاميد مونومر تركيز (ج) بالنسبة إلى مجموع مونومرات⁴. بعد الانفصال مع صفحة الجبهة الوطنية، مجمعات البروتين يمكن كذلك تقسيم إلى تلك المفارز البروتين الفردية بالبعد الثاني (2D)-الحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل لتحليل ثايلاكويد غشاء البروتين المجمعات من BN-صفحة/2D--الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.

Protocol

1. إعداد BN جل^1،،من²³

1. إعداد الناعم هلام مع لوحات 8 × 10 سم (زجاج مستطيلة ولوح مسنن الألومينا) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة باستخدام الفواصل 0.75 ملم.
2. خلاط تدرج على طبق من إثارة والاتصال مع مضخة تمعجية من أنابيب. إرفاق إبرة حقنه للنهاية الأخرى للأنبوب والإبرة بين لوحة الزجاج والألومنيوم. مكان محرض المغناطيسي إلى "الثقيلة" (ح)-الدائرة.
3. إعداد 3.5% (v/v) و 12.5% (v/v) الحلول اكريلاميد (أإ) في أنابيب الطرد المركزي المخروطية 15 مل للتدرج اللوني هلام فصل (انظر وصفات في الجدول 1). لمنع حدوث بلمرة المفاجئة، تبقى أنابيب الطرد المركزي على الجليد بينما كان يستعد الحلول.
   تنبيه: هو الاكريلاميد الأعصاب ومسببة للسرطان، ارتداء ملابس واقية وقفازات.
4. إضافة 5% APS وتيميد الحق قبل بيبيتينج الحلول لخالط التدرج. بيبيت الحل 12.5 في المائة إلى ح-الدائرة.
   1. إزالة فقاعات الهواء من قناة الاتصال "النور" (ل) وحاء-الدائرة عن طريق فتح صمام توصيل دائرتي يسمح الحل للدخول إلى قاعة ل. إغلاق صمام وبيبيت آثار حل مرة أخرى إلى ح-الدائرة.
   2. وأخيراً، بيبيت الحل 3.5 في المائة للأم-الدائرة.
5. التبديل على محرض المغناطيسي (سرعة إثارة ليست حاسمة، ولكن ينبغي لها أن تضمن خلط السليم من الحلول الثقيلة والخفيفة)، فتح الصمامات والتبديل على مضخة تمعجية. تسمح الحلول هلام التي تتدفق بين لوحة الزجاج والألومنيوم، وينبغي فلووراتي تقريبا 0.5 مل/دقيقة. يجب أن تكون الإبرة فوق السائل طوال الوقت، فإنه يمكن تركيبها على الجزء العلوي من لوحة زجاج مع شريط.
6. عندما قد أفرغت ح-ولالدوائر، ملئها بالماء عالي النقاوة وتسمح للماء بلطف تراكب سطح هلام. بلمرة جل يستغرق حوالي 1-2 ساعة في الرايت
7. إعداد الحل الاكريلاميد 3% (انظر وصفه في الجدول 1) التراص هلام في الرايت بيبيت هلام التراص على رأس جل فصل مبلمرة (قبل صب جل التراص، إزالة الماء فوق السطح جل) ووضع مشط جل عينة بين الزجاج والألومنيوم لوحة تجنب فقاعات الهواء.
   1. واسمحوا أن بلمرة 30-60 دقيقة في إزالة الرايت المشط بلطف تحت ماء عالي النقاوة. تخزين الهلام في ˚C + 4.
      نقطة توقف. ويمكن تخزين الهلام في ˚C + 4 لبضعة أيام. ينبغي أن يوضع الجل في ظروف رطبة لتجنب تجفيف الآبار وسطح هلام.

2-ثايلاكويد Solubilization^1،،من²³

ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات تحت ضوء خافت جداً. الاحتفاظ بعينات والمخازن المؤقتة على الجليد.

1. تمييع ثيلاكويدس معزولة مع المخزن المؤقت 25BTH20G المثلج إلى تركيز الكلوروفيل نهائي 1 ملغ/مل. لتحليل 2D--الجبهة الوطنية-الحزب الديمقراطي الصربي-صفحة تقريبا 4-8 ميكروغرام للكلوروفيل هو نموذج مناسب.
   ملاحظة: يجب أن يكون ثيلاكويدس المستخدمة في التجارب المعزولة من الأوراق الطازجة (للبروتوكول ثايلاكويد العزلة، انظر³)
2. إضافة وحدة تخزين متساوية من المخزن المؤقت للمنظفات، أي 2% β مارك ألماني (w/v) أو 2% ديجيتونين (w/v). خلط مواد التنظيف إلى عينة ثايلاكويد برفق مع نصيحة بيبيت وتجنب الوقوع في فقاعات الهواء. تركيز مواد التنظيف النهائي هو 1%، ومن ثيلاكويدس 0.5 ملغ شيلي/مل.
   1. جعل ثيلاكويدس لمدة 2 دقيقة على الجليد (β-مارك ألماني) أو 10 دقائق في الرايت مع خلط لطيف المستمر على الكرسي الهزاز/شاكر (ديجيتونين).
      ملاحظة: تستخدم عموما ديجيتونين و β-مارك ألماني ل solubilization ثايلاكويد البروتين المجمعات. إذا كان يتم استخدام المنظفات غير الأيونية الأخرى، تركيز المنظفات والوقت سولوبيليزيشن يجب أن يكون أولاً الأمثل. عادة المنظفات تركيز يتراوح من 0.5%-5% (v/v).
      تنبيه: هو ديجيتونين السامة وارتداء ملابس واقية وقفازات
3. إزالة المواد إينسولوبيليزيد بالطرد المركزي في 18,000 س ز لمدة 20 دقيقة، في ˚C + 4.
4. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة 1/10 (v/v) من المخزن المؤقت لمصرف البحرين المركزي للعينة.
   ملاحظة: عند النظر في التشكيل العام لمجمعات البروتين غشاء ثايلاكويد، تحديد العائد والمجال ثايلاكويد تمثيل الكسر solubilized المستحسن. لتحديد عائد المواد سولوبيليزيد، تأخذ 5 ميليلتر من المادة طافية على أنبوب جديد (قبل إضافة مصرف البحرين المركزي) وقياس محتوى شيلي وشيلي/ب نسبة⁵.

3-الجبهة الوطنية-الصفحة^1،،من²³

1. إعداد الجل إلى نظام التفريد عمودي (مثلاً 250 SE هوفر). ملء قاعة المخزن العلوي مع المخزن المؤقت كاثود الأزرق (انظر الجدول 1) وصب اﻷنود المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت لمجلس النواب.
2. تحميل نموذج ثايلاكويد (مثلاً، 5 ميكروغرام للكلوروفيل) في الآبار.
3. ابدأ التفريد وتدريجيا بزيادة الجهد: تم فصل 75 الخامس لمدة 30 دقيقة، 100 الخامس لمدة 30 دقيقة، 125 الخامس لمدة 30 دقيقة، 150 الخامس ح 1 و 175 الخامس حتى المجمعات تماما. تشغيل جل في + 4˚C، أما باستخدام غرفة باردة أو ضبط درجة الحرارة هلام مع نظام تبريد.
   ملاحظة: تغيير كاثود الأزرق المخزن المؤقت إلى المخزن مؤقت كاثود واضحة عند الجبهة عينة تم ترحيل حوالي ثلث الهلام.
4. بعد تشغيل الغرواني الكهربي، تفحص الجل مع فوتوسكانير لحفظ الصورة.

4-2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة

1. تجميع النظام الكهربائي العمودي (جل حجم 16 × 20 سم). استخدام الفواصل 1 مم.
2. إعداد معيار الحزب الديمقراطي الصربي هلام (12% الاكريلاميد، 6 م اليوريا، وصفه انظر الجدول2) مع 2D-مشط (واحدة كبيرة أيضا لقطاع غزة، وكذلك معيار واحد لعلامة الوزن الجزيئي).
3. قص حارة من BN-جل ووضعه في أنبوب (5 مل). إضافة 2 مل لايملي المخزن المؤقت (الذي يحتوي على 5% β-ميركابتوثانول) واحتضان قطاع لمدة 45 دقيقة مع الهز لطيف في الرايت
4. ضع لين، مع مساعدة من مثل فاصل، على رأس جل تجنب فقاعات الهواء.
5. بيبيت 5 ميليلتر من الوزن الجزيئي علامة على قطعة ضيقة من ورق الترشيح ومكان الورقة في مستوى جيدا.
6. لختم قطاع BN-جل وورقة ماركر، صب 0.5% [اغروس] (في تشغيل المخزن المؤقت) على رأس قطاع جل والسماح لترسيخ.
7. إجراء التفريد وفقا للبروتوكولات القياسية. بعد تشغيل الغرواني الكهربي، تصور البروتينات مع مثلاً، وصمة عار روبي سيبرو أو الفضة تلطيخ وفقا⁶.

النتائج

نظام 2D-الجبهة الوطنية/الحزب الديمقراطي الصربي صفحة ممثل في الشكل 1 يوضح الفصل بين ديجيتونين ومجمعات البروتين بيتا-مارك ألماني-solubilized ثايلاكويد وتركيبتها وحدة فرعية تفصيلية البروتين. نمط معقد البروتين ديجيتونين سولوبيليزيد ثيلاكويدس (جل الأفقي في أعلى ع?...

Discussion

إليه تحويل الطاقة الضوئي يتكون من مجمعات البروتين مولتيسوبونيت الكبيرة، التي يتم تضمينها في الغشاء ثايلاكويد. ويصف هذا البروتوكول طريقة أساسية لتحليل ثايلاكويد مصنع البروتين المجمعات من نبات التمويل مع صفحة الجبهة الوطنية جنبا إلى جنب مع 2D-الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. البروتوكول ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813