ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Summary

פרוטוקול עבור הבהרה של הצמח תילקואיד חלבון הארגון מורכבים ו הלחנה אצל כחול לזיהוי יליד ג'ל אלקטרופורזה (בסון-עמוד) ותיאר 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול ממוטבת עבורו תודרנית לבנה, , אבל ניתן להשתמש עבור שאר מיני צמחים עם שינויים מזעריים.

Abstract

שרשרת העברת אלקטרונים פוטוסינתטיים (וכו ') ממירה אנרגיה סולארית אנרגיה כימית בצורה של nadph ל ו- ATP. ארבעה מתחמי חלבון גדולה מוטבע תילקואיד ממברנה הקציר האנרגיה הסולארית להסיע אלקטרונים מן המים NADP⁺ ויה photosystems שני, ולהשתמש מעבר הצבע שנוצר פרוטון לייצור ATP. Photosystem PSII, סאי, ציטוכרום b₆f (Cyt b₆נ) ו- ATPase הם כל מכלולי multiprotein עם אוריינטציה ברורים ואת הדינמיקה בתוך הקרומית תילקואיד. ניתן לקבל מידע חיוני על הרכב ואת האינטראקציות של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד solubilizing את מתחמי מן שלמות הממברנה על ידי חומרי ניקוי עדין ואחריו ג'ל יליד electrophoretic הפרדת מתחמי. כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) היא שיטה אנליטית משמש הפרדת חלבונים מתחמי בצורתם הטבעית ופונקציונליים. השיטה יכול לשמש עבור חלבון טיהור מורכבים עבור ניתוח מבנה מפורטת יותר, אבל הוא גם מספק כלי כדי לנתח את האינטראקציות דינמי בין מתחמי חלבון. השיטה פותחה עבור הניתוח של מתחמי מיטוכונדריאלי חלבון בדרכי הנשימה, אבל מאז כבר אופטימיזציה, ויש משופרת עבור ניתוח מתחמי חלבון תילקואיד. כאן, אנו מספקים פרוטוקול עדכני מפורט לניתוח של מתחמי חלבון פוטוסינתטיים יציב ואת האינטראקציות שלהם ב תודרנית לבנה.

Introduction

חלבון multisubunit גדולה קומפלקסים photosystem PSII, Cyt b₆f ו- ATPase, גם לתאם בייצור של nadph ל ATP בתגובות אור פוטוסינתטיים. ב מהכלורופלסט צמח גבוה, מתחמי ממוקמים ממברנה תילקואיד, אשר הוא מבנה הממברנה הטרוגנית מבחינה מבנית, הכוללת appressed grana משתית הלא-appressed thylakoids. כחול מקורי לזיהוי בג'ל (בסון-עמוד) היא שיטה בשימוש נרחב בניתוח של חלבון multisubunit גדולה מתחמי בצורתם הטבעית, פעילים ביולוגית. השיטה הוקמה עבור ניתוח ממברנה מיטוכונדריאלי חלבון מתחמי¹, אך מאוחר יותר הותאם אישית לצורך הקמת מכשול ההפרדה של חלבון מתחמי תילקואיד רשת קרום, או³. השיטה מתאימה (i) לטיהור של מתחמי חלבון תילקואיד בודדים עבור ניתוח מבנה, (ii) לקביעת יליד אינטראקציות בין חלבונים מתחמי ו- (iii) לניתוח של ארגון הכולל מתחמי חלבון בעת שינוי רמזים סביבתיים.

לפני ההפרדה, מתחמי חלבון מבודדים מן הקרום עם חומרי ניקוי nonionic שנבחרו בקפידה, אשר הם קלים בדרך כלל, לשמר את המבנה המקורי של קומפלקסים חלבונים. חומרי ניקוי מכילים הידרופובי, אתרים הידרופיליות, טופס הקזאין יציב מעל ריכוז מסוים, נקרא ריכוז micellar קריטי (CMC). הגדלת ריכוז דטרגנט שמעל תוצאות CMC שיבוש של אינטראקציות השומנים-השומנים, את solubilization של מתחמי חלבון. הבחירה של דטרגנט תלוי על יציבותו של החלבונים עניין את יכולת solubilization של הנוזל. בשימוש שגרתי דטרגנטים כוללים α/β-dodecyl-maltoside digitonin. בעקבות solubilization של חלבון מתחמי במצבם המקורי, חומרים לא מסיסים יוסר על ידי צנטריפוגה. בצמחים גבוה יותר, קרום תילקואיד מאוד נדלנית במבנה, עכורה (למשל, digitonin) solubilize באופן סלקטיבי רק חלק מסוים של קרום³. לכן, כדי לאפיין הארגון מורכבים חלבון או את האינטראקציות בין מתחמי חלבון, זה קריטי תמיד לקבוע את יכולת solubilization של הנוזל שבחרת על-ידי קביעת התכנים כלורופיל, של כלורופיל / b יחס של תגובת שיקוע לאמוד את התשואה והתחום תילקואיד מייצגים (sub), בהתאמה, של השבר solubilized. היחס כלורופיל / b ב- thylakoids שלם של צמחים acclimated צמיחה-אור הוא בדרך כלל בסביבות 3, ואילו קלוא / b הערך של שברים תילקואיד מועשר או grana או stroma thylakoids יורד מתחת (~ 2.5) או חורג (~ 4.5) את הערך של סה כ thylakoids, בהתאמה.

כדי לספק מטען שלילי מתחמי חלבון, Coomassie (CBB) מבריק צבע כחול נוסף מדגם solubilized. בעקבות שינויי תשלום, חלבון מתחמי נודדים לכיוון האנודה ומופרדים על מעבר צבע אקרילאמיד (AA) על פי מסה מולקולרית והצורה שלהם. ברזולוציה גבוהה ויעילה ההפרדה מושגת באמצעות הדרגה ריכוז אקרילאמיד ליניארי. במהלך אלקטרופורזה, מתחמי חלבון נודדים לכיוון האנודה עד שיגיעו למגבלת גודל הנקבוביות שלהם תלוי בגודל. הנקבובית-הגודל של ג'ל לזיהוי תלוי אקרילאמיד הכולל (i) /bis- אקרילאמיד ריכוז (T) ו- (ii) על מחדש bis- אקרילאמיד מונומר ריכוז (ג) ביחס מונומרים סה כ⁴. לאחר ההפרדה עם בסון-דף, מתחמי חלבון נוסף נחלקים החלבוניות בודדים שלהם על ידי השנייה-מימד (2D) - מרחביות - דף. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט לניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת בסון-/ 2D מרחביות עמוד.

Protocol

1. הכנת בסון ג'ל^1,2,3

1. בצע כיוונון גלגלית ג'ל עם לוחות 8 ס"מ x 10 ס"מ (זכוכית מלבני וצלחת אלומינה מחורץ) על פי הוראות היצרן באמצעות מפרידי 0.75 מ מ.
2. במקום מערבל צבע על צלחת מערבבים וחבר אותו עם המשאבה ממברנות מאת אבובים. מחט מזרק לצרף הקצה השני של הצנרת ולמקם את המחט בין לוח אלומיניום וזכוכית. המקום פגים כדי "כבד" (H)-הקאמרית.
3. הכן 3.5% (v/v) ו- 12.5% (v/v) פתרונות אקרילאמיד (AA) 15מל צנטריפוגה חרוט צינורות למעבר הצבע ג'ל ההפרדה (ראו מתכונים ב טבלה 1). כדי למנוע הפילמור בטרם עת, לשמור הצינורות צנטריפוגה על הקרח תוך הכנת את הפתרונות.
   זהירות: אקרילאמיד היא העצבים ומסרטנים, ללבוש בגדים מגן וכפפות.
4. להוסיף 5% נכון APS, TEMED לפני pipetting את הפתרונות מערבל צבע. Pipet הפתרון 12.5% לתא-H.
   1. הסר את בועות האוויר בערוץ המחבר את "אור" (L) H-תא על-ידי פתיחת המסתם חיבור שני התאים המאפשר פתרון להיכנס לתא-L. סגור את השסתום ואת pipet שהעקבות של פתרון חזרה לתא-H.
   2. לבסוף, pipet הפתרון 3.5% לתא-L.
5. . הפעילי את פגים (המהירות של וההדים אינה קריטית, אך זה צריך להבטיח לערבב הפתרונות קל), פתח את השסתומים, להחליף את משאבת סחרור. לאפשר את הפתרונות ג'ל לזרום בין לוח אלומיניום וזכוכית, flowrate צריכה להיות בערך 0.5 mL/min. המחט חייב להיות מעל הנוזל כל הזמן, אותו ניתן לחבר את החלק העליון של לוח הזכוכית עם קלטת.
6. כאשר H ו- L-תאי - השתמשתי, למלא אותם במים הנדסה גנטית ולאפשר מים כדי כיסוי בעדינות את משטח ג'ל. הפילמור ג'ל אורכת בסביבות 1-2 שעות-RT.
7. להכין את הפתרון אקרילאמיד 3% (ראו מתכון טבלה1) על הערימה ג'ל-RT. Pipet את הג'ל הערמה על גבי הג'ל polymerized ההפרדה (לפני השלכת את הג'ל הערמה, הסר את המים על-ידי כיסוי השטח ג'ל) ומניחים מסרק ג'ל מדגם בין אלומיניום וזכוכית צלחת הימנעות בועות האוויר.
   1. מאפשרים פולימריזציה 30-60 דקות ב RT. להסיר המסרק בעדינות מתחת למים הנדסה גנטית. אחסן את הג'ל-הלעפה תרוטרפמט +4.
      השהה נקודה. ניתן לאחסן את הג'ל-+4 הלעפה תרוטרפמט לכמה ימים. יש לשמור את הג'ל בתנאי לחות כדי למנוע ייבוש הבארות, השטח ג'ל.

2. תילקואיד Solubilization^1,2,3

הערה: כל השלבים צריכה להתבצע באור עמום. לשמור דגימות מאגרים על קרח.

1. לדלל thylakoids מבודדים עם מאגר 25BTH20G קר כקרח כדי ריכוז כלורופיל הסופי של 1 מ"ג/מ"ל. עבור ניתוח 2D-בסון מרחביות-עמודים בערך 4-8 µg של כלורופיל מדגם זה מתאים.
   הערה: thylakoids להשתמש בניסויים חייב להיות מבודד עלים טריים (עבור פרוטוקול של תילקואיד בידוד, ראה³)
2. הוסף אמצעי שווה של מאגר דטרגנט, קרי, 2% β-DM (w/v) או 2% digitonin (w/v). לערבב הנוזל לדגימת תילקואיד בעדינות עם קצה pipet, להימנע מביצוע בועות אוויר. הריכוז הסופי של הנוזל הוא 1% של thylakoids 0.5 מ ג קלוא/mL.
   1. Solubilize את thylakoids למשך 2 דקות על קרח (β-מיט) או 10 דקות ב RT עם ערבוב עדין רציפה על נדנדה/מטרף (digitonin).
      הערה: Digitonin וβ-מיט משמשים בדרך כלל עבור solubilization של מתחמי תילקואיד חלבון. אם נעשה שימוש בדטרגנטים ללא יונית אחרים, ריכוז דטרגנט ואת הזמן solubilization חייב להיות קודם אופטימיזציה. בדרך כלל ריכוז דטרגנט בטווח של 0.5% - 5% (v/v).
      זהירות: Digitonin היא toxic, ללבוש בגדים מגן וכפפות
3. להסיר את החומר insolubilized על ידי צנטריפוגה-g x 18,000 עבור 20 דקות, בהלעפה תרוטרפמט +4.
4. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5 מ"ל ולהוסיף 1/10 (v/v) מאגר CBB המדגם.
   הערה: כאשר הרכב הכולל מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד נבדק, קביעת התשואה והתחום תילקואיד מייצגים של שבר solubilized מומלץ. כדי לקבוע את התשואה של החומר solubilized, לקחת 5 µL של תגובת שיקוע צינור (לפני הוספת CBB) ולמדוד את התוכן קלוא ואת קלוא / b יחס⁵.

3. בסון-עמוד^1,2,3

1. להגדיר את ג'ל אלקטרופורזה אנכי במערכת (למשל, Hoefer SE 250). למלא את התא העליון מאגר עם מאגר קטודית כחול (ראה טבלה 1) ויוצקים אנודת מאגר לתא מאגר נמוכה יותר.
2. לטעון תילקואיד מדגם (למשל, 5 µg של כלורופיל) לתוך הבארות.
3. להתחיל את אלקטרופורזה ולהגדיל בהדרגה את המתח: 75 V למשך 30 דקות, 100 וולט למשך 30 דקות, 125 V למשך 30 דקות, 150 V עבור 1 h של 175 V עד מתחמי הופרדו לחלוטין. הפעל את ג'ל- + 4˚C, או באמצעות חדר קר או התאמת הטמפרטורה ג'ל עם מערכת קירור.
   הערה: לשנות המאגר קטודית כחול למאגר קטודית ברורה כאשר החזית לדוגמה יש היגרו כשליש של הג'ל.
4. לאחר electrophoretic לברוח, לסרוק את הג'ל עם photoscanner עבור התמונה בארכיון.

4. 2D-מרחביות-דף

1. להרכיב מערכת אלקטרופורזה אנכי (ג'ל גודל 16 ס"מ על 20 ס"מ). השתמש מפרידי 1 מ מ.
2. להכין מרחביות סטנדרטי ג'ל (אקרילאמיד 12%, אוריאה מ' 6, ראו מתכון בטבלה מס ' 2) עם מסרק 2D (יחיד גדול גם עבור רצועת וכל אחד סטנדרטי עבור סמן משקל מולקולרי).
3. לחתוך את ליין מ בסון-ג'ל ולמקם אותו בצינור (5 מ"ל). להוסיף 2 מ של מאגר Laemmli (מכיל 5% β-mercaptoethanol), דגירה רצועת למשך 45 דקות עם טלטול עדין-RT.
4. מקם את ליין, עם עזרה של למשל, כרווח, על גבי הג'ל הימנעות בועות אוויר.
5. Pipet 5 µL של משקל מולקולרי סמן על פיסת צר מסנן נייר ומקום הנייר בתקן טוב.
6. לאטום רצועת בסון-ג'ל, העיתון סמן, שופכים 0.5% agarose (בניהול מאגר) מעל רצועת ג'ל ולאפשר לגבש.
7. לבצע אלקטרופורזה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. לאחר הפעלת electrophoretic, דמיינו את החלבונים עם למשל, הכתם עברית או כסף מכתים על פי⁶.

תוצאות

מערכת 2D-בסון/מרחביות-עמוד נציג באיור 1 מדגים ההפרדה של digitonin וβ-DM-solubilized תילקואיד חלבון מתחמי והרכבן יחידה משנית חלבון מפורט. הדפוס חלבונים מורכבים של digitonin solubilized thylakoids (אופקי ג'ל על גבי בראש איור 1A) מכיל את megacomplex PSII-LHCII-PSI, שני supercomplexes PSII-LHCII ג...

Discussion

המנגנון המרת אנרגיה פוטוסינתטיים מורכב קומפלקסים גדולים חלבון multisubunit, אשר מוטבעות ממברנה תילקואיד. פרוטוקול זה מתאר שיטה בסיסית לניתוח של מתחמי חלבון תילקואיד צמח מ תודרנית לבנה עם בסון-דף בשילוב עם 2D-מרחביות עמודים. הפרוטוקול מתאים גם לניתוח של תילקואיד מתחמי חלבון מן thylakoids טבק ותר...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813