Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch blaue Native Gelelektrophorese

Zusammenfassung

Ein Protokoll für die Aufklärung der Pflanze Thylakoidmembran Protein komplexe Organisation und Zusammensetzung mit blauen native Polyacrylamid gel-Elektrophorese (BN-Seite) und 2D-SDS-PAGE beschrieben. Das Protokoll ist optimiert für Arabidopsis Thaliana, aber für andere Pflanzenarten mit geringfügigen Modifikationen eingesetzt werden.

Zusammenfassung

Photosynthetische Electron Transfer Kette (usw.) wandelt Sonnenenergie in chemische Energie in Form von NADPH und ATP. Vier große Proteinkomplexe eingebettet in die Thylakoidmembran Membran Ernte Solarenergie Elektronen aus dem Wasser auf NADP⁺ über zwei photosysteme zu fahren, und die erstellten Proton Steigung für Produktion von ATP. Photosystem PSII, PSI, Cytochrom b₆f (Cyt b₆d) und ATPase sind alle Multi-komplexe mit eindeutigen Ausrichtung und Dynamik in der Thylakoidmembran Membran. Wertvolle Informationen über die Zusammensetzung und die Interaktionen der Proteinkomplexe in der Thylakoidmembran Membran erhalten Sie durch Gefäss-komplexe aus der Membran Integrität von Feinwaschmittel gefolgt von native Gel elektrophoretische Trennung von der -komplexe. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine analytische Methode für die Trennung der Proteinkomplexe in ihrer nativen und funktionale Form verwendet. Die Methode eignet sich für komplexe Proteinreinigung für genauere strukturelle Analyse, sondern es bietet auch ein Werkzeug, um die dynamischen Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu sezieren. Die Methode wurde entwickelt für die Analyse der mitochondrialen Atmung Proteinkomplexe, aber seitdem optimiert und verbessert für die Zerlegung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll auf dem neuesten Stand für die Analyse der labile photosynthetischen Proteinkomplexe und ihrer Wechselwirkungen in Arabidopsis Thaliana.

Einleitung

Großen speziellen Protein-komplexe Photosystem PSI und PSII, Cyt b₆f und ATPase koordinieren die Herstellung von NADPH und ATP in photosynthetischen Licht Reaktionen. In höheren Pflanzen Chloroplasten die komplexe in der Thylakoidmembran Membran befinden sich ein strukturell heterogenen Membran-Struktur, bestehend aus anliegenden Grana und nicht anliegenden Stroma Thylakoids. Blaue native Polyacrylamid Gelelektrophorese (BN-Seite) ist eine extensiv genutzte Methode bei der Analyse von großen speziellen Proteinkomplexe in ihrer nativen und biologisch aktive Form. Die Methode wurde für die Zerlegung des Mitochondrien-Membran-Protein-komplexe¹, aber später für die Trennung von Proteinkomplexen aus der Thylakoidmembran Membran Netzwerk³angepasst wurde. Die Methode eignet sich (i) für die Reinigung der einzelnen Thylakoidmembran Proteinkomplexe für Baustatik, (Ii) zur Bestimmung der native Interaktionen zwischen Proteinkomplexe und (Iii) für die Analyse der Gesamtorganisation der Proteinkomplexe nach dem ändern ökologische Hinweise.

Vor der Trennung sind Proteinkomplexe isoliert von der Membrane mit sorgfältig ausgewählten nichtionische Reinigungsmitteln, die in der Regel mild und bewahren die native Struktur der Protein-komplexe. Waschmittel enthalten hydrophoben und hydrophilen Seiten und Form stabilen Micellen ab einer gewissen Konzentration genannt eine kritische Mizellen Konzentration (CMC). Erhöhung der Waschmittel Konzentration über den CMC-Ergebnissen in Störungen der Lipid-Lipid-Interaktionen und die Solubilisierung von Proteinkomplexen. Die Wahl des Waschmittels hängt von der Stabilität des Proteins von Interesse und die Solubilisierung Kapazität des Waschmittels. Routinemäßig verwendeten Reinigungsmittel sind α/β-Dodecyl-maltosid und Digitonin. Im Anschluss an die Solubilisierung Proteinkomplexe in ihrem nativen Zustand wird unlöslichen Material durch Zentrifugieren entfernt. In höheren Pflanzen die Thylakoidmembran Membran ist sehr heterogene Struktur und einige Reinigungsmittel (z. B. Digitonin) anderweitig selektiv nur einen bestimmten Bruchteil der Membran³. Um die Protein-komplexe Organisation oder die Wechselwirkungen zwischen der Proteinkomplexe zu charakterisieren, ist es daher entscheidend, die Solubilisierung Kapazität des gewählten Waschmittels bestimmen Sie immer durch die Bestimmung der Chlorophyllgehalt und Chlorophyll A/b Verhältnis der überstand den Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran (Sub) Domain bzw. der solubilized Fraktion bewerten. Das Chlorophyll A/b-Verhältnis in intakten Thylakoids Wachstum-Licht gewöhnt Pflanzen ist in der Regel etwa 3, während die Chl ein / b-Wert der Thylakoidmembran Fraktionen bereichert entweder in Grana oder Stroma Thylakoids (~ 2,5) unterschreitet oder überschreitet (~ 4,5) den Wert des gesamten Thylakoids, beziehungsweise.

Um negative Ladung, die Proteinkomplexe zu bieten, wird die solubilized Beispiels Coomassie brillianter blau (CBB) Farbstoff hinzugefügt. Durch die Verschiebung kostenlos Proteinkomplexe in Richtung Anode Wandern und auf einer Steigung von Acrylamid (AA) entsprechend ihrer molekularen Masse und Form getrennt sind. Effektive und hochauflösende Trennung wird mithilfe einer linearen Acrylamid Konzentration Steigung erreicht. Während der Elektrophorese Wandern die Proteinkomplexe in Richtung der Anode bis sie ihre größenabhängige Porengröße Grenze erreichen. Die Porengröße der Polyacrylamid-Gel hängt (i) die gesamte Acrylamid /BIZAcrylamid - Konzentration (T) und (Ii) auf den Vernetzer bis- Acrylamid monomerkonzentration (C) im Verhältnis zu den gesamten Monomere⁴. Nach der Trennung mit BN-Seite können die Proteinkomplexe weiter durch die zweite Dimension (2D) - SDS - PAGE in ihre einzelnen Protein-Untereinheiten unterteilt werden. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Analyse der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe durch BN-Seite/2D-SDS-PAGE.

Protokoll

1. Vorbereitung BN Gel^1,2,3

1. Richten Sie die Gel-Caster mit 8 x 10 cm-Platten (rechteckige Glas- und gekerbten Aluminiumoxid Platte) nach Herstellerangaben mit 0,75 mm spacer.
2. Legen Sie einen Gradienten Mischer auf einen rühren Teller und verbinden Sie es mit der peristaltischen Pumpe durch ein Rohr. Das andere Ende des Schlauches eine Spritzennadel beimessen und die Nadel zwischen Glas und Aluminium Platte platzieren. Magnetrührer Ort zu "schwer" (H)-Kammer.
3. Bereiten Sie die 3,5 % (V/V) und 12,5 % (V/V) Acrylamid (AA) Lösungen in 15 mL konische Zentrifuge Röhren für die Trennung Gel Steigung (siehe Rezepte in Tabelle 1). Zur Vermeidung von vorzeitigen Polymerisation halten Sie die Zentrifuge Rohre auf dem Eis während der Vorbereitung der Lösungen.
   Achtung: Acrylamid ist neurotoxisch und krebserregend, schützende Kleidung und Handschuhe.
4. Fügen Sie 5 % APS und TEMED direkt vor dem pipettieren der Lösungen für den Farbverlauf Mixer hinzu. Pipettieren der 12,5 % Lösung für die H-Kammer.
   1. Der Kanal verbindet das "Licht" (L) und H-Kammer durch Öffnen des Ventils zwischen die beiden Kammern, so dass Lösung an die L-Kammer betreten entfernen Sie Luftblasen. Schließen Sie das Ventil und pipettieren, die die Spuren der Lösung zur H-Kammer zurück.
   2. Zu guter Letzt die 3,5 % ige Lösung an die L-Kammer pipettieren.
5. Schalten Sie den Magnetrührer (die Geschwindigkeit der Aufregung ist nicht kritisch, aber sie sollten sicherstellen, richtige Mischung der schweren und leichten Lösungen), öffnen Sie die Ventile und Peristaltische Pumpe einschalten. Die Gel-Lösungen zwischen Glas und Aluminium Platte fließen lassen, den Durchfluß sollte etwa 0,5 mL/min. Die Nadel muss oberhalb der Flüssigkeit ständig, es kann in den oberen Teil der Glasplatte mit einem Band befestigt werden.
6. Wenn die H und L-Kammern geleert haben, füllen sie mit Reinstwasser und lassen Sie Wasser sanft die Geloberfläche überlagern. Die Gel-Polymerisation dauert etwa 1-2 Stunden bei RT
7. Bereiten Sie die 3 % Acrylamid-Lösung (siehe Rezept in Tabelle 1) für das Stapeln gel bei RT pipettieren stapelnde Gel auf das polymerisierte Trennung Gel (vor dem Gießen des stapelnden Gels, entfernen Sie das Wasser, die Überlagerung der Geloberfläche) und legen Sie einen Probe Gel Kamm zwischen Glas und Aluminium Platte Vermeidung von Luftblasen.
   1. 30-60 min bei RT. entfernen Sie den Kamm sanft unter Reinstwasser polymerisieren lassen. Speichern Sie das Gel bei + 4 ° c.
      Pausenpunkt. Das Gel kann ein paar Tage bei + 4 ° c aufbewahrt werden. Das Gel sollte in den feuchten Bedingungen zu vermeiden, Trocknen von den Brunnen und die Geloberfläche gehalten werden.

(2) Thylakoidmembran Solubilisierung^1,2,3

Hinweis: Unter sehr schwachem Licht sollten alle Schritte durchgeführt werden. Halten Sie Proben und Puffer auf Eis.

1. Isolierte Thylakoids mit eiskalten 25BTH20G Puffer zu einer endgültigen Chlorophyllkonzentration von 1 mg/mL zu verdünnen. Für 2D-BN-SDS-PAGE-Analyse etwa 4 bis 8 µg des Chlorophylls / Probe eignet.
   Hinweis: Die Thylakoids, die in den Experimenten verwendet muss von frischen Blätter (für Protokoll der Thylakoidmembran Isolation, siehe³) isoliert werden.
2. Fügen Sie ein gleiches Volumen an Waschmittel Puffer, d. h. 2 % β-DM (w/V) oder 2 % Digitonin (w/V). Mischen Sie das Waschmittel in die Thylakoidmembran Probe vorsichtig, mit der Spitze pipettieren und verhindern Sie, dass Luftblasen. Die letztendliche Konzentration des Reinigungsmittels ist 1 % und der Thylakoids 0,5 mg Chl/mL.
   1. Lösen Sie die Thylakoids für 2 min auf Eis (β-DM) oder 10 min bei RT mit kontinuierlichen schonendes mischen auf einer Wippe/Shaker (Digitonin).
      Hinweis: Digitonin und β-DM sind in der Regel für die Solubilisierung der Thylakoidmembran Proteinkomplexe verwendet. Wenn andere nicht-ionische Reinigungsmittel verwendet werden, müssen die Waschmittel Konzentration und die Solubilisierung Zeit zunächst optimiert werden. In der Regel die Waschmittel Konzentrationsbereich zwischen 0,5 % und 5 % (V/V).
      Achtung: Digitonin ist giftig, tragen Sie schützende Kleidung und Handschuhe
3. Entfernen Sie das insolubilized Material durch Zentrifugation bei 18.000 x g für 20 min bei + 4 ° c.
4. Übertragen Sie den überstand auf eine neue 1,5 mL Tube und fügen Sie 1/10 (V/V) von CBB Puffer zur Probe.
   Hinweis: Bei der Prüfung der Gesamtkomposition der Thylakoidmembran Membran-Protein-komplexe Bestimmung der Ertrag und die vertretenen Thylakoidmembran Domäne solubilisiert Fraktion empfiehlt. Um die Rendite des solubilized Materials zu bestimmen, nehmen Sie 5 µL des Überstands zu einem neuen Schlauch (vor dem Hinzufügen von CBB) und messen die Chl Inhalt und Chl eine / b-Verhältnis⁵.

(3) BN-Seite^1,2,3

1. Richten Sie das Gel zu einem vertikalen Elektrophorese-System (z. B. Hoefer SE 250). Die oberen Sperrkammer mit blauen Kathode Puffer füllen (siehe Tabelle 1) und Anode Puffer für das Unterhaus Puffer zu gießen.
2. Thylakoidmembran Probe (z. B. 5 µg des Chlorophylls) in die Vertiefungen zu laden.
3. Die Elektrophorese zu beginnen und schrittweise Erhöhung der Spannung: 75 V für 30 min, 100 V für 30 min, 125 V für 30 min, 150 V für 1 h und V 175 bis die komplexe wurden vollständig getrennt. Führen Sie das Gel bei + 4˚C, entweder mit einem kalten Raum oder Temperaturstellung Gel mit einem Kühlsystem.
   Hinweis: Ändern des blauen Kathode Puffers auf einen klaren Kathode Puffer, wenn die Probe Front etwa ein Drittel des Gels migriert hat.
4. Scannen Sie nach dem elektrophoretischen Lauf das Gel mit einem Photoscanner für Bildarchivierung.

(4) 2D-SDS-PAGE

1. Montieren Sie das vertikale Elektrophorese-System (Gel Größe 16 x 20 cm). Verwenden Sie 1 mm spacer.
2. Bereiten Sie standard SDS-Gel (12 % Acrylamid, 6 M Harnstoff, Rezept siehe Tabelle2) mit einem 2D-Kamm (einzigen großen gut für den Strip und eine standard für Molekulargewicht Marker).
3. Schneiden Sie die Spur von BN-Gel und legen Sie sie in einem Rohr (5 mL). Fügen Sie 2 mL Laemmli-Puffer (mit 5 % β-Mercaptoethanol) und inkubieren Sie den Streifen für 45 min mit sanft schütteln bei RT
4. Legen Sie die Spur mit Hilfe von z. B. einen Spacer auf das Gel Luftblasen zu vermeiden.
5. Pipettieren 5 µL Molekulargewicht Marker auf einem schmalen Stück Filterpapier und legen Sie das Papier auf den Standard gut.
6. Zur Abdichtung der BN-Gel-Streifen und das Marker-Papier, 0,5 % Agarose (im laufenden Puffer) auf dem Gel-Strip Gießen und erstarren lassen.
7. Durchführen Sie Elektrophorese nach Standardprotokollen. Nachdem die elektrophoretische ausgeführt, visualisieren Sie die Proteine mit z. B. Sypro Ruby Fleck oder Silber Färbung nach⁶.

Ergebnisse

Ein repräsentatives 2D-BN/SDS-PAGE-System in Abbildung 1 zeigt die Trennung von Digitonin und β-DM-solubilisiert Thylakoidmembran Proteinkomplexe und ihre detaillierte Proteinzusammensetzung Untereinheit. Das Protein komplexe Muster der Digitonin solubilisiert Thylakoids (horizontale Gel oben auf der Spitze Figur 1A) enthält die PSII LHCII PSI Megacomplex, zwei große PSII LHCII Supercomplexes (sc), PSI-LHCII Supercomplex, PSI...

Diskussion

Die photosynthetische Energie Umwandlung Maschinen besteht aus großen speziellen Proteinkomplexe, die in die Thylakoidmembran Membran eingebettet sind. Dieses Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode zur Analyse der Pflanze Thylakoidmembran Proteinkomplexe von Arabidopsis Thaliana mit BN-Seite zusammen mit 2D-SDS-PAGE. Das Protokoll eignet sich auch für die Analyse der Thylakoidmembran Proteinkomplexe aus Tabak und Spinat Thylakoids, aber kleine Anpassungen erfordern.

Für die...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813