Análisis de los complejos de la proteína de membrana de tilacoides por electroforesis nativa azul

Resumen

Un protocolo para la aclaración de planta tilacoides proteína compleja organización y composición con poliacrilamida nativa azul gel electroforesis (BN-PAGE) y 2D-SDS-PAGE se describe. El protocolo está optimizado para Arabidopsis thaliana, , pero puede ser utilizado para otras especies de plantas con modificaciones menores.

Resumen

Cadena de transferencia de electrones fotosintética (ETC) convierte energía solar en energía química en forma de NADPH y ATP. Cuatro grandes complejos integrados en la energía solar de la cosecha la membrana del thylakoid para conducir electrones del agua al NADP⁺ a través de dos fotosistemas y el gradiente del protón creada para la producción de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) y ATPasa son todos los complejos de multiproteínas con distinta orientación y dinámica de la membrana del thylakoid. Puede obtenerse información valiosa sobre la composición e interacciones de los complejos de proteína en la membrana del thylakoid solubilizando los complejos de la integridad de la membrana por detergentes suaves, seguidos por separación electroforética gel nativo de la complejos. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método analítico utilizado para la separación de complejos de proteína en su forma nativa y funcional. El método puede ser utilizado para la purificación de complejos de proteínas para análisis estructural más detallado, pero también proporciona una herramienta para analizar las interacciones dinámicas entre los complejos de proteína. El método fue desarrollado para el análisis de los complejos respiratorios mitocondriales, pero desde entonces ha optimizado y mejorado para la disección de los complejos de proteína de tilacoides. Presentamos un protocolo actualizado detallado para el análisis de los complejos fotosintéticos lábil y sus interacciones en Arabidopsis thaliana.

Introducción

Grande multisubunit proteína complejos fotosistema PSI y PSII, Cyt b₆f y ATPasa coordinan la producción de NADPH y de ATP en las reacciones de luz fotosintéticas. En cloroplastos de plantas superiores, los complejos se encuentran en la membrana del thylakoid, que es una estructura de membrana estructuralmente heterogéneo, compuesto por Appresso grana y tilacoides de estroma no appressed. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) es un método ampliamente utilizado en el análisis de complejos de grande multisubunit proteína en su forma natural y biológicamente activo. El método se estableció para la disección de la membrana mitocondrial proteínas complejos¹, pero más tarde se ha personalizado para la separación de complejos de la proteína de la membrana de tilacoides red³. El método es adecuado (i) para la purificación de complejos proteicos de tilacoides individuales para análisis estructural, (ii) para determinar las interacciones nativas entre complejos de la proteína y (iii) para el análisis de la organización general de los complejos de la proteína a cambio de señales ambientales.

Antes de la separación, complejos de la proteína están aislados de la membrana con cuidada detergentes no iónicos, que son generalmente leves y preservar la estructura de los complejos de la proteína nativa. Los detergentes contienen hidrófobos y sitios hidrofílicos y micelas estable forma por encima de cierta concentración, llamada concentración micelar crítica (CMC). Aumento de la concentración de detergente sobre los resultados de la CMC en la interrupción de las interacciones lípido lípido y en la solubilización de complejos de la proteína. La elección del detergente depende la estabilidad de la proteína de interés y de la capacidad de solubilización del detergente. Detergentes usados habitualmente son α/β-dodecil-maltoside y digitonin. Después de la solubilización de complejos de proteína en su estado nativo, material insoluble se elimina por centrifugación. En las plantas superiores, la membrana del thylakoid es altamente heterogénea en la estructura y algunos detergentes (por ejemplo, digitonin) solubilizan selectivamente sólo una fracción específica de la membrana³. Por lo tanto, para caracterizar la organización compleja de la proteína o las interacciones entre los complejos de proteínas, es crucial determinar siempre la capacidad de solubilización del detergente solicitada por determinar el contenido de clorofila y la clorofila a/b proporción de sobrenadante para evaluar el rendimiento y el dominio mentionada tilacoides (sub), respectivamente, de la fracción solubles. La relación clorofila a/b en tilacoides intacto de luz de crecimiento plantas aclimatadas es típicamente alrededor de 3, mientras que la chl un / b el valor de fracciones de tilacoides en grana enriquecido o tilacoides de estroma inferior (~ 2,5) o superior (~ 4.5) el valor del total tilacoides, respectivamente.

Para proporcionar carga negativa a los complejos de proteínas, colorante de (CBB) de azul brillante de Coomassie se agrega a la muestra solubilizada. Debido al cambio de carga, complejos de proteínas migran hacia el ánodo y se separan en un gradiente de acrilamida (AA) según su masa molecular y la forma. Eficaz y de alta resolución de la separación se logra utilizando un gradiente de concentración de acrilamida lineal. Durante la electroforesis, los complejos de proteínas migran hacia el ánodo hasta llegar a su límite de tamaño de poro de tamaño dependiente. El tamaño del poro del gel de poliacrilamida depende de (i) el total acrilamida /bis- acrilamida concentración (T) y (ii) en la vinculante bis- acrilamida monómero concentración (C) en relación con los monómeros total⁴. Después de la separación con la página de la BN, los complejos de proteína pueden subdividirse aún más en sus subunidades de la proteína individual por segunda dimensión (2D) - SDS - PAGE. Aquí, describimos un protocolo detallado para el análisis de complejos de la proteína de la membrana del thylakoid por BN-PAGE/2D-SDS-PAGE.

Protocolo

1. preparación de BN Gel^1,2,3

1. Configurar la rueda de gel con las placas de 8 x 10 cm (rectangular de vidrio y placa de alúmina con muescas) según instrucciones del fabricante utilizando a espaciadores de 0,75 mm.
2. Poner un mezclador de gradiente sobre una placa de agitación y conectar con la bomba peristáltica por una tubería. Coloque una aguja de jeringa en el otro extremo de la tubería y colocar la aguja entre la placa de vidrio y aluminio. Agitador magnético de lugar a la "pesada" (H)-cámara.
3. Preparar el 3,5% (v/v) y el 12,5% (v/v) soluciones de acrilamida (AA) en tubos de centrífuga cónico de 15 mL para el gradiente del gel de separación (ver recetas en el cuadro 1). Para evitar la polimerización prematura Mantenga los tubos de la centrífuga en el hielo mientras se preparan las soluciones.
   PRECAUCIÓN: La acrilamida es guantes y ropa protectora neurotóxico y cancerígeno, desgaste.
4. Añadir 5% APS y TEMED la derecha antes de pipetear las soluciones al mezclador de gradiente. Pipeta de la solución de 12,5% a la cámara de H.
   1. Quite las burbujas de aire del canal de conexión de la "luz" (L) y H-cámara abriendo la válvula que conecta las dos cámaras que permite la solución entrar a la cámara de L. Cierre la válvula y pipetee que los rastros de solución hacia H-cámara.
   2. Por último, pipeta de la solución 3.5% para la cámara de L.
5. Encender el agitador magnético (la velocidad de la agitación no es crítica, pero debe asegurar una mezcla adecuada de las soluciones ligeras y pesadas), abrir las válvulas y del interruptor de la bomba peristáltica. Que las soluciones de gel fluya entre la placa de vidrio y el aluminio, el caudal debe ser aproximadamente 0,5 mL/min. La aguja debe estar por encima el líquido todo el tiempo, se puede conectar a la parte superior de la placa de cristal con una cinta.
6. Cuando las cámaras H y L estén vacíos, llenarlos con agua ultrapura y agua a cubrir suavemente la superficie del gel. La polimerización del gel toma alrededor de 1-2 horas a TA.
7. Preparar la solución de acrilamida del 3% (ver receta en la tabla 1) para el apilamiento de gel en RT. Pipetee el gel de apilamiento en la parte superior del gel polimerizado separación (antes de emitir el gel de apilamiento, retire el agua de la superficie del gel de sobreposición) y coloque un peine de gel muestra entre el vidrio y el aluminio la placa evitando las burbujas de aire.
   1. Dejar para polimerizar 30-60 min en RT. quitar el peine suavemente bajo el agua ultrapura. Guarde el gel en el ° c + 4.
      Punto de pausa. El gel puede almacenarse a + 4 ° c por unos días. El gel se debe mantener en condiciones de humedad para evitar que se sequen los pozos y la superficie del gel.

2. tilacoides solubilización^1,2,3

Nota: Todas las medidas deben realizarse bajo luz muy tenue. Mantener las muestras y tampones en el hielo.

1. Tilacoides aislados diluida con buffer 25BTH20G helada a una concentración de clorofila final de 1 mg/mL. Para análisis 2D-BN-SDS-PAGE aproximadamente 4-8 μg de clorofila muestra es adecuada.
   Nota: Los tilacoides utilizadas en los experimentos deben estar aislada de las hojas frescas (para protocolo de aislamiento de tilacoides, ver³)
2. Añadir un volumen igual de buffer detergente, es decir, 2% β-DM (w/v) o 2% digitonin (w/v). Mezcle el detergente a la muestra de tilacoides suavemente con la punta de la pipeta y evitar burbujas de aire. La concentración final del detergente es 1% y la de los tilacoides 0.5 mg Chl/mL.
   1. Solubilizar los tilacoides por 2 min en hielo (β-DM) o 10 minutos a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una mecedora shaker (digitonin).
      Nota: Digitonin y β-DM se utilizan generalmente para la solubilización de complejos de proteína de tilacoides. Si se utilizan detergentes no iónicos, la concentración de detergente y el tiempo de solubilización deben optimizarse primero. Generalmente el concentración de detergente van de 0.5-5% (v/v).
      PRECAUCIÓN: Digitonin es tóxico, llevar ropa protectora y guantes
3. Retire el material insolubilized por centrifugación a 18.000 x g por 20 min, a + 4 ° c.
4. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL y añadir 1/10 (v/v) de tampón de enganche a la muestra.
   Nota: Cuando se examina la composición general de los complejos de proteínas de membrana de tilacoides, determinar el rendimiento y el dominio de tilacoides mentionada de fracción solubilizado se recomienda. Para determinar el rendimiento del material solubilizado, tomar 5 μl del sobrenadante a un tubo nuevo (antes de agregar el CBB) y medir el contenido de Chl y Chl un / b cociente⁵.

3. BN-PAGE^1,2,3

1. Configurar el gel a un sistema de electroforesis vertical (por ejemplo, Hoefer SE 250). Llene la cámara de amortiguación superior con tampón de cátodo azul (ver tabla 1) y verter buffer ánodo a la cámara inferior del tampón.
2. Carga de tilacoides muestra (por ejemplo, 5 μg de clorofila) en los pocillos.
3. La electroforesis y aumente gradualmente la tensión: 75 V durante 30 minutos, 100 V durante 30 minutos, 125 V por 30 min, 150 V durante 1 h y 175 V hasta los complejos se han separado completamente. Correr el gel a + 4, uso de cuarto frío o ajustar la temperatura del gel con un sistema de refrigeración.
   Nota: Cambiar el búfer del cátodo azul a un búfer de cátodo claro cuando el frente de la muestra ha emigrado cerca de un tercio del gel.
4. Después del análisis electroforético, escanear el gel con un escáner fotográfico de archivo de imagen.

4. 2D-SDS-PAGE

1. Montar el sistema de electroforesis vertical (gel tamaño 16 cm x 20 cm). Usar a separadores de 1 mm.
2. Preparación estándar del gel de SDS (12% de acrilamida, 6 M Urea, ver las recetas en el cuadro 2) con un peine de 2D (solo gran bien para la tira y bien estándar para el marcador de peso molecular).
3. Cortar el carril de BN-gel y colocar en un tubo (5 mL). Añadir 2 mL de Tampón Laemmli (contiene 5% β-mercaptoetanol) e incubar a la franja de 45 min con agitación suave a TA.
4. Coloque el carril, con la ayuda de por ejemplo, un separador, en la parte superior del gel, evitando burbujas de aire.
5. Pipeta de 5 μl del marcador de peso molecular en una estrecha franja de papel de filtro y coloque el papel para el estándar bien.
6. Para sellar la tira BN-gel y el papel del marcador, vierte agarosa 0.5% (en buffer de marcha) en la parte superior la tira de gel y dejar para solidificar.
7. Realizar electroforesis según protocolos estándar. Después de la electroforesis, visualizar las proteínas con p. ej., tinción Sypro Ruby o coloración según⁶de plata.

Resultados

Un sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE en la figura 1 muestra la separación de digitonin y complejos de la proteína β-DM-solubilizado tilacoides y su composición de la subunidad de proteína detallada. El patrón complejo de proteína de digitonin solubilizado tilacoides (gel horizontal en la parte superior la parte superior de la figura 1A) contiene el PSII-LHCII-PSI megacomplex, dos grandes supercomplexes de PSII-LHCII...

Discusión

El mecanismo de conversión de energía fotosintética está compuesto por complejos de grande multisubunit proteína, que se incrustan en la membrana de los tilacoides. Este protocolo describe un método básico para el análisis de los complejos de proteína de tilacoides plantas de Arabidopsis thaliana con BN-PAGE junto con 2D-SDS-PAGE. El protocolo también es adecuado para el análisis de los complejos de la proteína del thylakoid de tilacoides tabaco y espinacas, pero puede necesitar pequeños retoques.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813