Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Özet

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Özet

Fotosentetik Elektron transferi zinciri (vb) NADPH ve ATP şeklinde kimyasal enerji güneş enerjisi dönüştürür. Dört büyük protein kompleksleri elektron sudan NADP⁺ ile iki photosystems için sürücü ve ATP üretimi için oluşturulan proton degrade kullanmak için thylakoid membran hasat güneş enerjisi gömülü. Photosystem PSII, psişik, sitokrom b₆f (Cyt b₆f) ve ATPaz farklı yönlendirme ve thylakoid membran dinamikleri ile tüm multiprotein kompleksleri vardır. Kompozisyon ve thylakoid membran protein kompleksleri etkileşimleri hakkında değerli bilgiler elde hafif deterjan yerli jel elektroforetik ayrımı tarafından takip tarafından kompleksleri membran bütünlüğü gelen çözücü tarafından kompleksleri. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) protein kompleksleri yerli ve fonksiyonel formlarındaki ayrılması için kullanılan bir analitik yöntemdir. Yöntem protein kompleksi arıtma daha ayrıntılı yapısal analizi için kullanılabilir, ama aynı zamanda protein kompleksleri arasındaki dinamik etkileşimler incelemek için bir araç sağlar. Yöntem mitokondrial solunum protein kompleksleri, analiz için geliştirilmiştir ama beri en iyi duruma getirilmiş ve thylakoid protein kompleksleri diseksiyon için geliştirilmiş. Burada, biz değişken fotosentetik protein kompleksleri ve onların etkileşimlerde Arabidopsis thalianaanalizi için detaylı güncel iletişim kuralı sağlar.

Giriş

Büyük multisubunit protein kompleksleri photosystem PSI ve PSII, Cyt b₆f ve ATPaz koordine NADPH ve ATP üretimi fotosentetik ışık reaksiyonlarda. Daha yüksek bitki kloroplast içinde kompleksleri appressed grana ve appressed stroma thylakoids oluşan bir yapısal olarak heterojen membran yapıdır thylakoid zarının içinde yer alır. Mavi yerli polyacrylamide jel elektroforez (BN-sayfa) büyük multisubunit protein kompleksleri onların yerli ve biyolojik olarak aktif biçimde analizinde yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Yöntem mitokondrial membran protein kompleksleri¹diseksiyon için kuruldu, ancak sonra thylakoid membran ağ³protein kompleksleri ayrılması için özelleştirilmiş. Yöntem (i) tek tek thylakoid protein kompleksleri için yapısal analizi, (ii) yerli protein kompleksleri Hofstede belirlemek için ve (iii) protein kompleksleri genel organizasyonu analizi için arıtma için uygundur çevre ipuçları değiştirme üzerine.

Ayrılık öncesinde protein kompleksleri genellikle hafiftir ve protein kompleksleri doğal yapısını korumak dikkatle seçilmiş Nonyonik deterjanlar ile membran etkilenmezsiniz. Deterjanlar içeren hidrofobik ve hidrofilik siteleri ve form istikrarlı micelles bir belirli konsantrasyon, yukarıda adı verilen bir kritik micellar konsantrasyonu (CMC). CMC sonuçlarının lipid-lipid etkileşimleri bozulma ve protein kompleksleri solubilization üzerinde deterjan konsantrasyonu artan. Deterjan seçimi protein kompleksi ilgi kararlılığını ve deterjan solubilization kapasitesine bağlıdır. Rutin olarak kullanılan deterjanlar α/β-Lauryl-maltoside ve digitonin içerir. Protein kompleksleri içinde onların yerli durum solubilization çözünmez malzeme Santrifüjü tarafından kaldırılır. Yüksek bitkilerde thylakoid membran yapısı içinde son derece heterogenic ve bazı deterjanlar (Örneğin, digitonin), seçmeli olarak membran³yalnızca belirli bir kısmını solubilize. Bu nedenle, protein kompleksi kuruluş ya da protein kompleksleri arasındaki etkileşimler ayırdetmek için bu her zaman klorofil içeriği ve klorofil a/b belirleyerek seçilen deterjan solubilization kapasitesini belirlemek önemlidir verim ve temsil thylakoid (sub) etki alanı, sırasıyla, solubilized kısmını değerlendirmeye süpernatant sayısına oranı. Büyüme-ışık iklime alıştırılacağı bitkilerin sağlam thylakoids klorofil a/b oranı genellikle yaklaşık 3, ise chl bir / b değeri thylakoid kesirler zenginleştirilmiş grana birinde veya stroma thylakoids düşer (~ 2.5 altında) veya (~ 4.5) toplam değerini aşıyor thylakoids, anılan sıraya göre.

Protein kompleksleri için negatif yük sağlamak için Coomassie parlak mavi (CBB) boya solubilized örneğe eklenir. Şarj kayması nedeniyle protein kompleksleri anot doğru göç ve molekül ağırlığı ve şekil göre bir Akrilamid (AA) degrade olarak ayrılır. Etkili ve yüksek çözünürlüklü ayırma doğrusal akrilamid konsantrasyon gradyanı kullanılarak elde edilir. Onlar kendi boyut bağımlı gözenek boyutu sınırına ulaşıncaya kadar Elektroforez sırasında protein kompleksleri anot doğru göç. (İ toplam akrilamid polyacrylamide jel gözenek büyüklüğüne bağlıdır /bis- akrilamid konsantrasyonu (T) ve (II) cross-linker bis- akrilamid monomer konsantrasyonu (C) göre toplam monomerleri⁴. BN-sayfa ile boşanmadan sonra protein kompleksleri daha fazla onların bireysel protein alt ikinci boyut (2D) - SDS - sayfa tarafından alt. Burada, thylakoid membran protein kompleksleri BN-/ 2D SDS-sayfa tarafından çözümlenmesi için detaylı bir protokol açıklayın.

Protokol

1. hazırlanması BN jel^1,2,3

1. Jel tekeri plakalı 8 cm x 10 cm (dikdörtgen cam ve çentikli alümina plaka) 0,75 mm mesafe tutucular kullanarak üretici yönergelerine göre ayarlayın.
2. Bir degrade karıştırıcı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir tüp tarafından peristaltik pompa ile bağlayın. Bir şırınga iğnesi tüp diğer ucunu takın ve cam ve alüminyum plaka arasında iğne yerleştirin. "Ağır" (H) için yer manyetik karıştırıcı-odası.
3. %3.5 (v/v) ve (v/v) % 12.5 15 mL konik santrifüj tüpleri çözümlerinde Akrilamid (AA) ayırma jel degrade için hazırlamak (bkz. Tablo 1tariflerde). Zamansız polimerizasyon önlemek için çözümler hazırlarken santrifüj tüpleri buz üzerinde tutun.
   Dikkat: Akrilamid nörotoksik ve kanserojen, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler var.
4. % 5 APS ve TEMED doğru çözümler degrade Mixer pipetting önce ekleyin. Damlalıklı H-Odası % 12.5 çözümü.
   1. Hava kabarcıkları "light" (L) ve H-odası L odasına girmek çözüm sağlayan iki odaları bağlanma Vana açarak bağlanma kanal kaldırın. Çözüm izleri H-odasına geri Vana ve damlalıklı kapatın.
   2. Son olarak, damlalıklı L-odası % 3,5 çözümü.
5. Manyetik karıştırıcı geçiş (heyecan hız kritik değildir, ancak uygun ağır ve hafif çözümler karıştırma emin olmalısınız), vanaları açın ve peristaltik pompa geçin. Cam ve alüminyum plaka arasında akmaya jel çözümleri sağlar, debisi yaklaşık 0.5 mL/dk olmalı. İğne sıvı her zaman olmalı, cam levha bir bant ile üst kısmındaki eklenebilir.
6. Ne zaman H ve L chambers boşluk, onları Ultrasaf Su ile doldurun ve yavaşça jel yüzeyi yerleşimi için su sağlar. Jel polimerizasyon 1-2 saat civarında RT. alır.
7. %3 akrilamid çözüm hazırlamak (bkz. Tablo 1' deki tarifi) istifleme için RT. damlalıklı polimerli ayrılık jel üstüne yığın jel jel (yığın jel döküm önce jel yüzeyi overlaying su kaldırmak) ve bir örnek jel tarak yer Cam ve alüminyum plaka kaçınarak hava kabarcıkları arasında.
   1. 30-60 dk RT. Kaldır tarak yavaşça Ultrasaf Su altında az polimerize olanak sağlar. 4 ˚C, jel saklayın.
      Durma noktası. Jel 4 ˚C bir kaç gün saklanabilir. Jel kuyuları ve jel yüzey kurutma önlemek için nemli ortamlarda tutulmalıdır.

2. Thylakoid Solubilization^1,2,3

Not: Tüm adımları çok loş ışık altında yapılmalıdır. Örnekleri ve arabellekleri buz üzerinde tutun.

1. Buz gibi 25BTH20G arabellek son klorofil konsantrasyonu 1 mg/ml ile izole thylakoids oranında seyreltin. İçin klorofil 2D-BN-SDS-sayfa analizi yaklaşık 4-8 µg / örnek uygundur.
   Not: deneylerde kullanılan thylakoids (için protokol thylakoid yalıtım, bkz:³) taze yaprakları yalıtılmış olması gerekir
2. Eşit miktarda deterjan arabellek, Yani, % 2 β-DM (w/v) veya % 2 eklemek digitonin (w/v). Thylakoid örnek için deterjan karışımı yavaşça damlalıklı ucu ile ve hava kabarcıkları yapmaktan kaçının. Son deterjan % 1 ve thylakoids 0,5 mg Chl/mL olan bölgedir.
   1. Thylakoids 2 dakika buz (β-DM) veya RT sürekli nazik bir rocker/shaker (digitonin) karıştırma ile 10 dakika solubilize.
      Not: Digitonin ve β-DM genellikle thylakoid protein kompleksleri solubilization için kullanılır. Diğer non-iyonik deterjanlar kullandıysanız, deterjan konsantrasyon ve solubilization saat önce optimize edilmiş olması gerekir. Genellikle deterjan konsantrasyon aralığı üzerinden % 0.5-%5 (v/v).
      Uyarı: Toksik, aşınma koruyucu elbise ve eldivenler Digitonin olduğunu
3. İnsolubilized malzeme Santrifüjü 18.000 x g 4 ˚C, 20 dk için de çıkarın.
4. Yeni bir 1,5 mL tüp süpernatant nakletmek ve 1/10 (v/v) CBB arabelleği için örnek eklemek.
   Not: thylakoid membran protein kompleksleri genel kompozisyon incelendiğinde, verim ve çözündürüldükten kesir temsil thylakoid etki alanını belirleme önerilir. Solubilized malzeme verim belirlemek için (CBB eklemeden önce) için yeni bir tüp süpernatant ile 5 µL al ve Chl içerik ve Chl ölçmek bir / b oranı⁵.

3. BN-sayfa^1,2,3

1. Jel bir dikey elektroforez sistemi (Örneğin, Hoefer SE 250) için ayarlayın. Üst arabellek odası mavi katot arabellek ile doldurun (bkz. Tablo 1) ve anot arabellek alt arabellek odasına dökün.
2. Thylakoid örnek (Örneğin, 5 klorofil µg) kuyu yükleyin.
3. Elektroforez başlayın ve yavaş yavaş voltajı artırmak: 75 V 30 dk için 30 dk için 100 V, 125 V 30 dk, 150 V 1 h için ve 175 V kompleksleri kadar ayrılmış tamamen. Koşmak, jel + 4˚C, soğuk bir oda kullanma ya da jel sıcaklık soğutma sistemi ile ayarlama.
   Not: örnek açık yaklaşık üçte biri jel göç mavi katot arabellek açık katot arabellek için değiştirmiş olursunuz.
4. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra jel ile görüntü arşivleme için bir photoscanner inceden inceye gözden geçirmek.

4. 2D-SDS-SAYFA

1. Dikey elektroforez sistemi (jel boyutu 16 cm x 20 cm) bir araya getirin. 1 mm boşluk ekleyiciler kullanın.
2. 2D-tarak (tek büyük şerit ve molekül ağırlığı işaretçi için bir standart iyi için iyi) ile standart SDS jel (% 12 akrilamid, 6 M üre, Tablo 2' deki bkz: tarifi) hazırlayın.
3. Lane BN-jel keser ve bir (5 mL) tüpe yerleştirir. Laemmli arabellek (%5 β-mercaptoethanol içeren) 2 mL ekleyin ve nazik RT. sallayarak ile 45 dk için şerit kuluçkaya
4. Örneğin, ayırıcı, üstünde tepe-in hava kabarcıkları kaçınarak jel yardımıyla ile lane yerleştirin.
5. Damlalıklı 5 µL molekül ağırlığı işaretçisini filtre kağıdı ve yer iyi standart kağıt dar bir parçası üzerinde.
6. BN-jel şerit ve marker kağıt imzalamaya, (içinde tampon çalıştıran) % 0.5 özel jel şerit üzerine dökün ve kuvvetlendirmek için izin.
7. Elektroforez standart protokolleri göre gerçekleştirin. Elektroforetik çalıştırdıktan sonra proteinler ile Örneğin, Sypro Ruby leke veya gümüş göre⁶boyama görselleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1 ' deki temsilcisi bir 2D-BN/SDS-sayfa sistemi digitonin ve β-DM-çözündürüldükten thylakoid protein kompleksleri ayrılması ve kendi detaylı protein alt birimi kompozisyon göstermektedir. Çözündürüldükten digitonin thylakoids ( Şekil 1Aüst üstte Yatay jel) protein karmaşık desen içerir PSII-LHCII-PSI megacomplex, iki büyük PSII-LHCII supercomplexes (sc), PSI-LHCII supercomplex, PSI monomer (m), PSI...

Tartışmalar

Fotosentetik enerji dönüşüm makine thylakoid membran gömülü büyük multisubunit protein kompleksleri oluşur. Bu iletişim kuralı için çözümleme-in bitki thylakoid protein kompleksleri Arabidopsis thaliana BN sayfalı 2D-SDS-sayfa ile kombine ile gelen temel yöntemi açıklanır. Protokolü de thylakoid protein kompleksleri gelen tütün ve ıspanak thylakoids çözümlenmesi için uygundur, ama ufak değişiklikler gerektirebilir.

Membran protein kompleksleri solubiliza...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813