Análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por electroforese em Gel azul nativo

Resumo

Um protocolo para a elucidação da planta tilacoides proteína complexa organização e composição com poliacrilamida nativa azul gel eletroforese (BN-página) e 2D-SDS-PAGE é descrito. O protocolo é otimizado para a Arabidopsis thaliana, , mas pode ser usado para outras espécies de plantas com pequenas modificações.

Resumo

Cadeia de transferência de elétrons fotossintética (ETC) converte energia solar em energia química na forma de NADPH e ATP. Quatro grandes complexos de proteínas incorporado em tilacoides membrana colheita solar energia para conduzir os elétrons da água para NADP⁺ através de dois fotossistemas e usar o gradiente de prótons criado para a produção de ATP. Photosystem PSII, PSI, citocromo b₆f (Cyt b₆f) e ATPase são todos os complexos Multiproteicos com orientação distinta e dinâmica na membrana tilacoides. Informações valiosas sobre a composição e as interações dos complexos proteína na membrana tilacoides podem ser obtidas pelo solubilizing os complexos da integridade da membrana por detergentes suaves, seguidos pelo nativo gel de separação eletroforética do complexos. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método analítico usado para a separação de complexos de proteínas em sua forma nativa e funcional. O método pode ser usado para purificação de complexo de proteínas para análise estrutural mais detalhada, mas ele também fornece uma ferramenta para dissecar as interações dinâmicas entre os complexos de proteína. O método foi desenvolvido para a análise de complexos de proteína respiratória mitocondrial, mas desde então foi otimizado e melhorado para a dissecação dos complexos proteína tilacoides. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado atualizado para análise de complexos de proteínas fotossintéticas lábeis e suas interações em Arabidopsis thaliana.

Introdução

Proteína multisubunit grandes complexos fotossistema PSI e PSII, Cyt b₆f e ATPase coordenam a produção de NADPH e ATP em reações de luz fotossintéticas. Nos cloroplastos de plantas superiores, os complexos estão localizados na membrana tilacoides, que é uma estrutura de membrana estruturalmente heterogêneo, composto por grana apresso e não-apresso estroma contém. Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-página) é um método amplamente utilizado na análise de grandes multisubunit complexos de proteínas em sua forma nativa e biologicamente ativo. O método foi criado para a dissecção da proteína de membrana mitocondrial complexos¹, mas mais tarde foi personalizado para a separação dos complexos da proteína da membrana tilacoides rede³. O método é adequado (i) para a purificação de complexos de proteínas tilacoides individuais para análise estrutural, (ii) para determinar o nativas interações entre complexos de proteína e (iii) a análise da organização geral dos complexos da proteína Após alterar as sugestões ambientais.

Antes da separação, complexos da proteína são isolados da membrana com detergentes não iônicos cuidadosamente escolhidos, que são geralmente leves e preservar a estrutura nativa dos complexos da proteína. Detergentes contêm hidrofóbicos e hidrofílicos sites e micelas estável de forma acima de uma determinada concentração, chamado uma concentração crítica de micellar (CMC). Aumentando a concentração de detergente acima dos resultados CMC no rompimento das interações lipid-lipídico e a solubilização dos complexos da proteína. A escolha do detergente depende a estabilidade da proteína complexa de interesse e a capacidade de solubilização de detergente. Rotineiramente utilizados detergentes incluem α/β-dodecil-maltoside e digitonin. Após a solubilização dos complexos de proteína no seu estado nativo, material insolúvel é removido por centrifugação. Em plantas superiores, a membrana tilacoides é altamente heterogêneo em estrutura e alguns detergentes (por exemplo, digitonin) solubilizar seletivamente apenas uma fração específica da membrana³. Portanto, para caracterizar as interações entre os complexos de proteína ou proteína complexa organização, é crucial determinar sempre a capacidade de solubilização de detergente escolhido, determinando-se o teor de clorofila e a clorofila a/b relação de sobrenadante para avaliar o rendimento e o domínio representado tilacoides (sub), respectivamente, da fração solubilized. A clorofila a/b relação contém intacta de crescimento-luz acclimated plantas normalmente é em torno de 3, Considerando que a chl um / b valor de tilacoides frações enriquecidas em grana ou estroma contém cai abaixo (~ 2.5) ou superior (~ 4,5) o valor do total contém, respectivamente.

Para fornecer uma carga negativa para os complexos de proteína, a tintura de (CBB) azul brilhante de Coomassie é adicionada à amostra solubilized. Devido a mudança de carga, complexos de proteínas migram para o ânodo e são separados em um gradiente de acrilamida (AA) de acordo com sua massa molecular e a forma. Separação eficaz e de alta resolução é conseguida usando um gradiente de concentração de acrilamida linear. Durante a eletroforese, os complexos de proteína migram para o ânodo até atingirem o limite de tamanho de poro dependente do tamanho. O tamanho dos poros do gel de polyacrylamide depende (i) a acrilamida total /bis- acrilamida concentração (T) e (ii) sobre a cross-linker bis- acrilamida monômero concentração (C) em relação a monômeros total⁴. Após a separação com BN-página, os complexos de proteína podem ser subdivididos em suas subunidades de proteínas individuais por segunda dimensão (2D) - SDS - PAGE. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a análise de complexos de proteínas de membrana tilacoides por BN-página/2D-SDS-PAGE.

Protocolo

1. preparar BN^1,2,3 do Gel

1. Configure o rodízio de gel com placas de 8 x 10 cm (vidro retangular e placa entalhada da alumina) de acordo com as instruções do fabricante usando espaçadores de 0,75 mm.
2. Coloque num prato de agitar um mixer gradiente e conectá-lo com a bomba peristáltica por uma tubulação. Anexar uma agulha da seringa para a outra extremidade do tubo e colocar a agulha entre a placa de vidro e alumínio. Agitador magnético do lugar para o "pesados" (H)-câmara.
3. Preparar a 3,5% (v/v) e 12,5% (v/v), soluções de acrilamida (AA) em tubos de centrifuga conico de 15 mL para o gradiente de gel de separação (ver receitas no quadro 1). Para evitar a polimerização prematura, manter os tubos de centrífuga no gelo enquanto prepara as soluções.
   Atenção: A acrilamida é luvas e roupa protetora neurotóxico e carcinogênico, desgaste.
4. Adicione 5% APS e TEMED direito antes de pipetagem de soluções para o mixer gradiente. A solução de 12,5% para a H-câmara de pipeta.
   1. Remova as bolhas de ar do canal ligando a "luz" (L) e H-câmara abrindo a válvula conectando as duas câmaras, permitindo que a solução entrar para a câmara de L. Feche a válvula e pipetar que os vestígios da solução de volta à câmara-H.
   2. Finalmente, pipetar a solução de 3,5% para a câmara de L.
5. Ligue o agitador magnético (a velocidade da prisão não é crítica, mas deverá assegurar uma mistura adequada das soluções pesadas e leves), abrir as válvulas e ligar a bomba peristáltica. Permitir que o gel de soluções de fluxo entre a placa de vidro e alumínio, o caudal deve ser cerca de 0,5 mL/min. A agulha deve ser acima do líquido o tempo todo, pode ser colocado na parte superior da placa de vidro com uma fita.
6. Quando a H-L-câmaras e ter esvaziado, preenchê-los com água ultrapura e permitir que a água delicadamente sobrepor a superfície do gel. A polimerização do gel leva cerca de 1-2 horas em RT
7. Preparar a solução de acrilamida 3% (veja receita no quadro 1) para o empilhamento do gel em RT. Pipetar o gel de empilhamento do gel de separação polimerizado (antes de lançar o gel de empilhamento, remover a água cobrindo a superfície do gel) e colocar um pente de gel de amostra entre os vidro e alumínio placa evita bolhas de ar.
   1. Permita a polimerizar 30-60 min em RT. Remove o pente suavemente em água ultrapura. Armazene o gel no + 4 ˚ c.
      Ponto de pausa. O gel pode ser armazenado em + 4 ˚ c por alguns dias. O gel deve ser mantido em condições húmidas para evitar a secagem de poços e a superfície do gel.

2. tilacoides solubilização^1,2,3

Nota: Todas etapas devem ser executadas sob luz muito fraca. Mantenha as amostras e buffers em gelo.

1. Dilua contém isolado com buffer 25BTH20G gelada a uma concentração de clorofila final de 1 mg/mL. Para análise 2D-BN-SDS-PAGE aproximadamente 4-8 µ g de clorofila / amostra é adequada.
   Nota: A contém usado nos experimentos deve ser isolado de folhas frescas (para o protocolo de isolamento de tilacoides, ver³)
2. Adicionar um volume igual de buffer de detergente, ou seja, 2% β-DM (p/v) ou 2% digitonin (w/v). Misture o detergente com a amostra de tilacoides suavemente com a ponta da pipeta e evitar bolhas de ar. A concentração final de detergente é 1% e a da contém 0,5 mg Chl/mL.
   1. Solubilize o contém por 2 min no gelo (β-DM) ou 10 minutos no RT com mistura suave contínua um balancim/agitador (digitonin).
      Nota: Digitonin e β-DM são geralmente utilizados para a solubilização dos complexos de proteínas de tilacoides. Se outros detergentes não-iônicos são utilizados, a concentração de detergente e o tempo de solubilização devem ser primeiro otimizados. Geralmente o intervalo de concentração de detergente de 0,5% - 5% (v/v).
      Atenção: O Digitonin é tóxico, roupas protetoras e luvas
3. Remova o material insolubilized por centrifugação a 18.000 x g por 20 min, no + 4 ˚ c.
4. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 mL e adicionar 1/10 (v/v) do buffer CBB para a amostra.
   Nota: Ao examinar a composição global as complexos de proteínas de membrana tilacoides, determinar o rendimento e o domínio de tilacoides representado da fração solubilizado é recomendado. Para determinar o rendimento do material solubilized, tirar 5 µ l do sobrenadante para um tubo novo (antes de adicionar a CBB) e medir o conteúdo de Chl e Chl um / b relação⁵.

3. BN-página¹de^,2,3

1. Configure o gel para um sistema de eletroforese vertical (por exemplo, máquina SE 250). Encha a câmara de tampão superior com buffer de catodo azul (ver tabela 1) e despeje o buffer de ânodo para a câmara inferior do tampão.
2. Carregar exemplo de tilacoides (por exemplo, 5 µ g de clorofila) nos poços.
3. Começar a electroforese e aumentar gradualmente a tensão: 75 V por 30 min, 100 V por 30 min, 125 V por 30 min, 150 V por 1h e 175 V até os complexos foram separados completamente. Execute o gel à + 4˚C, usando uma sala fria ou ajustar a temperatura do gel com um sistema de refrigeração.
   Nota: Altere o buffer de catodo azul para um buffer de cátodo clara quando a frente de amostra migrou cerca de um terço do gel.
4. Após o funcionamento electrophoretic, digitalize o gel com uma photoscanner para o arquivamento de imagem.

4. 2D-SDS-PAGE

1. Monte o sistema de eletroforese vertical (gel de tamanho 16 cm x 20 cm). Utilize espaçadores de 1 mm.
2. Prepare padrão do gel de SDS (12% do acrilamido, 6 M ureia, veja receita no quadro 2) com um pente-2D (único grande bem para o strip-tease e um bom padrão para marcador de peso molecular).
3. Cortar a faixa de BN-gel e colocá-lo em um tubo (5 mL). Adicionar 2 mL de tampão de Laemmli (contendo 5% β-Mercaptoetanol) e incubar a tira por 45 min com agitação suave em RT
4. Coloque a pista, com a ajuda de , por exemplo, um espaçador, em cima do gel, evitando bolhas de ar.
5. Pipetar 5 µ l de marcador de peso molecular em um estreito pedaço de papel de filtro e coloque o papel com o padrão bem.
6. Para selar a tira de BN-gel e o papel do marcador, derrame agarose de 0,5% (em reserva de marcha) em cima da faixa de gel e reserve para solidificar.
7. Realize a eletroforese de acordo com protocolos padrão. Depois de executa o eletroforético, visualize as proteínas com por exemplo, mancha de Sypro Ruby ou prata coloração de acordo com⁶.

Resultados

Um sistema representativo de 2D-BN/SDS-PAGE na Figura 1 demonstra a separação de digitonin e complexos de proteína β-DM-solubilizado tilacoides e sua composição de subunidade de proteína detalhadas. O padrão complexo de proteínas de digitonin solubilizado contém (gel de horizontal na parte superior no topo da figura 1A) contém a megacomplex do FSII LHCII-PSI, duas grandes razões do FSII-LHCII (sc), supercomplex PSI-LH...

Discussão

As máquinas de conversão de energia fotossintética é composta por grandes multisubunit complexos de proteínas, que são encaixados na membrana tilacoides. Este protocolo descreve um método básico para análise dos complexos proteína vegetal tilacoides de Arabidopsis thaliana com BN-página combinada com 2D-SDS-PAGE. O protocolo é também adequado para a análise de complexos de proteínas tilacoides de tabaco e espinafre contém, mas pode precisar de pequenos ajustes.

Para a ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813