蓝色本机凝胶电泳法分析囊体膜蛋白配合物

摘要

本文介绍了用蓝色原生聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 和2维 SDS 页对植物囊体蛋白复合组织和成分进行澄清的一种协议。该协议是对拟南芥的优化, 但可以用于其他植物物种的小修改。

摘要

光合电子传递链 (等) 将太阳能转化为化学能和 ATP 的形式。四大蛋白复合物嵌入囊体膜收获太阳能, 以驱动电子从水到 NADP⁺ 通过两个-高等植物, 并使用创建的质子梯度生产 ATP。光系统 ii PSII, PSI, 细胞色素 b₆f (Cyt b₆f) 和 atp 酶是所有复合配合物, 具有明显的方向和动力学在囊体膜。用温和洗涤剂将复合物从膜的完整性中溶出, 然后用本机凝胶电泳分离, 可获得有关类囊体膜中蛋白质复合物组成和相互作用的宝贵信息。配合 物。蓝色本机聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种分析方法, 用于分离蛋白质复合物在其本机和功能形式。该方法可用于蛋白质复合纯化, 更详细的结构分析, 但也提供了一种解剖蛋白质复合物间动态相互作用的工具。该方法是为分析线粒体呼吸蛋白复合物而开发的, 但从那时起对囊体蛋白复合物的解剖进行了优化和改进。在此, 我们提供了一个详细的最新的协议, 以分析不稳定的光合蛋白复合物及其相互作用的拟南芥。

引言

大 multisubunit 蛋白配合物光系统 ii PSI 和 PSII, Cyt b₆f 和 atp 酶在光合光反应中协调和 atp 的生产。在高等植物叶绿体中, 复合物位于类囊体膜中, 它是一种结构上的异质膜结构, 包括贴伏粒和非贴伏基质类囊体。蓝原体聚丙烯酰胺凝胶电泳 (BN 页) 是一种广泛应用的方法, 用于分析大型 multisubunit 蛋白复合物的原生和生物活性形态。建立了线粒体膜蛋白配合物¹的解剖方法, 但后来又自定义为分离出囊体膜网络³的蛋白质复合物。该方法适用于 (i) 纯化单个囊体蛋白复合物进行结构分析, (ii) 确定蛋白质复合体之间的本机相互作用和 (iii) 分析蛋白质复合物的整体组织在变化的环境线索。

在分离之前, 蛋白质复合体是从膜中分离出来的, 经过精心挑选的非离子洗涤剂, 一般都是温和的, 保存着蛋白质复合体的原生结构。洗涤剂含有疏水性和亲水性的场所, 形成稳定的胶束在一定浓度之上, 称为临界胶束浓度 (CMC)。增加在 CMC 以上的洗涤剂浓度, 导致脂质脂相互作用的破坏和蛋白质复合物的增溶。洗涤剂的选择取决于感兴趣的蛋白质复合体的稳定性和洗涤剂的增溶能力。常规使用的洗涤剂包括α/β-月桂-maltoside 和 digitonin。随着蛋白质复合物在其原生状态下的溶解, 不溶性物质被离心去除。在高等植物中, 囊体膜在结构上高度异, 某些洗涤剂 (如digitonin) 选择性地溶解了膜³的特定部分。因此, 要确定蛋白质复合组织的特征或蛋白质复合物之间的相互作用, 必须通过确定叶绿素含量和叶绿素 a/b 来测定所选洗涤剂的增溶能力。上清比对可溶性分数的产量和所代表的囊体 (子) 域分别进行评估。生长光驯化植物完整类囊体中叶绿素 a/b 的比值通常在3左右, 而在粒或基质中富集的类囊体分数的值低于 (~ 2.5) 或超过 (~ 4.5) 总的值类囊体, 分别。

为了向蛋白质复合体提供负电荷, 考马斯蓝 (CBB) 染料添加到可溶性样品中。由于电荷转移, 蛋白质复合物向阳极迁移, 并根据分子质量和形状在丙烯酰胺 (AA) 梯度上分离。采用线性丙烯酰胺浓度梯度, 实现了高效、高分辨率分离。在电泳过程中, 蛋白质复合体向阳极迁移, 直到达到其大小依赖性的孔隙大小限制。聚丙烯酰胺凝胶的孔径大小取决于 (i) 总丙烯酰胺/双丙烯酰胺浓度 (T) 和 (ii) 对交叉连接器双丙烯酰胺单体浓度 (C) 相对于总单体⁴。与 BN 页分离后, 蛋白质复合物可进一步细分为各自的蛋白质亚基, 第二维 (2 d)-SDS 页。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 以分析的囊状体膜蛋白配合物的 BN-PAGE/2D-SDS-PAGE。

研究方案

1. 制备 BN 凝胶^1,2,3

1. 根据制造商的说明使用0.75 毫米垫片, 设置8厘米 x 10 厘米板 (矩形玻璃和缺口氧化铝板) 的凝胶脚轮。
2. 将渐变搅拌机放在搅拌板上, 用油管将其与蠕动泵连接。将注射器针连接到油管的另一端, 将针头放在玻璃和铝板之间。将磁力搅拌器放到 "重" (H) 室。
3. 准备 3.5% (v/v) 和 12.5% (v/v) 丙烯酰胺 (AA) 溶液在15毫升锥形离心机管为分离凝胶梯度 (参见食谱在表 1)。为防止过早聚合, 在准备溶液时, 将离心管放在冰上。
   注意: 丙烯酰胺是神经毒性和致癌物质, 穿戴防护服和手套。
4. 在吹打渐变混合器的解决方案之前, 先添加5% 个 ap 和 TEMED。吸管12.5% 溶液的 H 室。
   1. 从连接 "光" (L) 和 H 室的通道中取出气泡, 方法是打开连接两个腔的阀门, 使溶液进入 L 室。关闭阀门, 吸管溶液的痕迹回 H 室。
   2. 最后, 吸管了3.5% 解的 L 室。
5. 开关磁搅拌器 (搅拌速度不关键, 但应确保重和轻溶液的适当混合), 打开阀门和开关的蠕动泵。允许凝胶溶液在玻璃和铝板之间流动, 流量应约为0.5 毫升/分钟。针必须一直在液体的上方, 它可以用胶带附着在玻璃盘子的上部。
6. 当 H 和 L 室清空后, 用超纯水填充, 并允许水轻轻地覆盖凝胶表面。凝胶聚合需要大约1-2 小时在 RT。
7. 准备3% 丙烯酰胺溶液 (见表 1中的配方), 用于在 RT 上堆积凝胶. 吸管在聚合分离凝胶的顶部堆积凝胶 (在浇铸堆积凝胶之前, 去除水覆盖凝胶表面) 和放置一个样品凝胶梳子在玻璃和铝板之间避免气泡。
   1. 允许在 RT 聚合30-60 分钟. 在超纯水下轻轻取下梳子。将凝胶贮存在 +4 ˚C。
      暂停点。凝胶可以储存在 +4 ˚C 几天。凝胶应保持在潮湿的条件, 以避免干燥的水井和凝胶表面。

2. 类囊体增溶^1、2、3

注意: 所有步骤都应在非常昏暗的光线下执行。把样品和缓冲器放在冰上。

1. 稀释孤立类囊体与冰冷25BTH20G 缓冲到最后的叶绿素浓度为1毫克/毫升。对于2维 BN-SDS 页面分析大约4-8 µg 叶绿素/样品是合适的。
   注: 实验中使用的类囊体必须与新鲜的叶子分离 (对于囊体分离的协议, 见³)
2. 添加相同体积的洗涤剂缓冲液,即2% β DM (w/v) 或 2% digitonin (w/v)。用吸管尖轻轻地将洗涤剂与类囊体样品混合, 避免制造气泡。洗涤剂的最后集中是1% 和那类囊体0.5 毫克智利或 mL。
   1. 溶解类囊体为2分钟在冰 (β DM) 或10分钟在 RT 以连续的温和的混合在摇摆物或振动筛 (digitonin)。
      注: Digitonin 和β DM 通常用于囊体蛋白复合物的增溶。如果使用其他非离子洗涤剂, 必须首先优化洗涤剂浓度和溶解时间。通常洗涤剂的浓度范围从 0.5%-5% (v/v)。
      注意: Digitonin 有毒, 穿防护服和手套
3. 将 insolubilized 材料离心 1.8万 x 克, 20 分钟, +4 ˚C。
4. 将上清液转移到新的1.5 毫升管, 并将 CBB 缓冲器的 1/10 (v/v) 添加到样品中。
   注: 当检查类囊体膜蛋白配合物的整体组成时, 建议确定可溶性分数的产量和所代表的囊状体域。为了确定可溶性材料的收率, 将上清的5µL 到新管 (加入 CBB 之前), 测量叶绿素含量和叶绿素 a/b 比值⁵。

3. BN-页^1,2,3

1. 将凝胶设置为垂直电泳系统 (例如, Hoefer SE 250)。用蓝色阴极缓冲器填充上部缓冲腔 (见表 1), 并将阳极缓冲液倒入下部缓冲室。
2. 加载类囊体样品 (例如, 5 µg 叶绿素) 进入水井。
3. 开始电泳并逐步增加电压:75 V 为30分钟, 100 v 为30分钟, 125 v 为30分钟, 150 v 为 1 h 和 175 v, 直到复合体完全分离为止。在 + 4˚C 上运行凝胶, 或者使用冷室或用冷却系统调节凝胶温度。
   注: 当样品前端迁移了大约三个凝胶时, 将蓝色阴极缓冲器更改为透明阴极缓冲器。
4. 在电泳运行后, 用 photoscanner 扫描凝胶以进行图像存档。

4. 2 d-SDS 页

1. 组装垂直电泳系统 (凝胶尺寸16厘米 x 20 厘米)。使用1毫米垫片。
2. 准备标准 SDS 凝胶 (12% 丙烯酰胺, 6 M 尿素, 看见食谱在表 2) 与 2 d 梳子 (单大井为条和一个标准井为分子量标记)。
3. 切断从 BN 凝胶的车道, 并把它放在一个 (5 毫升) 管。加入2毫升的 Laemmli 缓冲液 (含5% β巯基乙醇), 并在 RT 中进行温和摇动, 孵化45分钟的带状。
4. 在胶圈的帮助下, 将车道放在一个隔板上, 避免气泡。
5. 吸管5µL 分子量标记在一条狭窄的滤纸上, 将纸张放在标准井上。
6. 要封住 BN 凝胶条和标记纸, 在凝胶条顶部倒入0.5% 琼脂糖 (在运行缓冲器中), 并允许凝固。
7. 根据标准协议进行电泳。电泳运行后, 可视化的蛋白质, 如,正如人体细胞红宝石染色或银染色根据⁶。

结果

图 1中有代表性的2维 BN/SDS 页系统显示了 digitonin 和β-DM-可溶性囊体蛋白复合物的分离及其详细的蛋白质亚基组成。digitonin 可溶性类囊体的蛋白质复合模式 (图 1A顶部的水平凝胶) 包含 PSII LHCII-PSI megacomplex、两个大型 PSII LHCII supercomplexes (sc)、psi LHCII supercomplex、PSI 单体 (m)、PSII m/Cytb₆f, 松散约束 (L)-LHCII 三聚体 (

讨论

光合能量转换机械由大型 multisubunit 蛋白复合物组成, 嵌在囊体膜中。该协议描述了一个基本的方法来分析的植物囊体蛋白复合物从拟南芥与 2 d-SDS 页结合。该协议也适用于分析烟草和菠菜类囊体类囊体蛋白复合物, 但可能需要小的调整。

对于膜蛋白复合物的增溶, 非离子洗涤剂通常用于保存其原生形式的复合物的能力。这里使用了两种常用的洗涤剂β DM 和 digitonin。月?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-aminocaproic acid (ACA)	Sigma-Aldrich	A2504
BisTris	Sigma-Aldrich	B4429
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Acrylamide (AA)	Sigma-Aldrich	A9099	Caution: Neurotoxic!
n-dodecyl-β-D-maltoside	Sigma-Aldrich	D4641
Tricine	Sigma-Aldrich	T0377
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
SDS	VWR	442444H
Urea	VWR	28877.292
Glycerol	J.T. Baker	7044
Sodium Fluoride (NaF)	J.T. Baker	3688
EDTA disodium salt	J.T. Baker	1073
Digitonin	Calbiochem	300410	Caution:Toxic!
Pefabloc SC	Roche	11585916001
Serva Coomassie Blue G	Serva	35050
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710
APS (Ammonium persulfate)	Bio-Rad	161-0700
TEMED (Tetramethylethylenediamine)	Bio-Rad	1610801
(N,N'-Methylene)-Bis-Acrylamide	Omnipur	2610
Glycine	Fisher	G0800
Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa)	New England Biolabs	P7708
Falcon, Conical Centrifuge Tubes 15 ml	Corning	352093
Dual gel caster with 10 x 8 cm plates	Hoefer	SE215
Gradient maker SG5	Hoefer
0.75 mm T-spacers	Hoefer	SE2119T-2-.75
Sample gel comb, 0.75 mm	Hoefer	SE211A-10-.75
Mighty Small SE250 vertical electrophoresis system	Hoefer	SE250
IPC-pump	Ismatec
Power supply, PowerPac HV	Bio-Rad	164-5097
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Rocker-Shaker	Biosan	BS-010130-AAI
PROTEAN II xi Cell	Bio-Rad	1651813